專利名稱：蝦夷扇貝鐵蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物抗病基因篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝦夷扇貝鐵蛋白基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研究表明鐵蛋白是一種重要的免疫蛋白，在維持胞內(nèi)鐵離子平衡和先天免疫系統(tǒng)中起著重要作用。鐵蛋白參與了海洋無脊椎動物的諸多重要生理過程，在炎癥反應(yīng)、鐵離子吸收、去氧化解毒等方面均有重要作用。比如，海灣扇貝經(jīng)鰻弧菌脅迫后，其體內(nèi)鐵蛋白水平有了明顯提高；同樣，太平洋白對蝦經(jīng)過白斑病毒感染后，鐵蛋白基因也明顯上調(diào)表達。此外，經(jīng)金屬離子及高溫脅迫處理后，血蛤的鐵蛋白也明顯提高，以上研究表明鐵蛋白在海洋無脊椎動物的先天免疫中起了重要作用。因此，篩選不同物種的鐵蛋白，從而更準確的檢 測海水養(yǎng)殖物種的免疫系統(tǒng)具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蝦夷扇貝鐵蛋白基因及其應(yīng)用，為貝類育種中病害防治提供技術(shù)手段，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。上述蝦夷扇貝鐵蛋白基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明還涉及用于表達上述的蝦夷扇貝鐵蛋白基因的重組載體。本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白用于制備抗菌劑。本發(fā)明克隆了蝦夷扇貝鐵蛋白基因，并對其體外重組表達產(chǎn)物進行了鐵氧化和抑菌活性分析。研究表明本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白不僅具有螯合鐵的功能，而且具有抑菌活性，能夠抑制貝類重要致病性細菌的生長。因此，蝦夷扇貝鐵蛋白在病害防治中具有良好的應(yīng)用潛能。


圖I :本發(fā)明的ife下夷扇貝鐵蛋白基因的序列分析圖；其中長方形方框中的為鐵反應(yīng)元件IRE ;實下劃線aataaa為加尾信號；虛下劃線為A + U不穩(wěn)定元件；圖2 :本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白的立體結(jié)構(gòu)圖；圖3 :本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白重組表達后的電泳圖；圖4 :本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白的鐵氧化活性檢測圖；圖5 :本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白的抗菌活性圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例I :蝦夷扇貝鐵蛋白基因的分離及性質(zhì)分析本發(fā)明中的蝦夷扇貝鐵蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步驟a)蝦夷扇貝總RNA提取；b)蝦夷扇貝5’ RACE和3’ RACE文庫構(gòu)建；
c)蝦夷扇貝鐵蛋白cDNA全長序列的獲得；d)目的基因的生物信息學分析。具體操作如下a)蝦夷扇貝總RNA的提取按照trizol提取方法從蝦夷扇貝肝胰腺中提取總RNA。b)奸夷扇貝 RACE文庫構(gòu)建利用 Clontech公司 SMART RACE cDNA AmplificationKit 構(gòu)建 5’ RACE 和 3’ RACE 文庫。c)蝦夷扇貝鐵蛋白cDNA全長序列的獲得根據(jù)蝦夷扇貝轉(zhuǎn)錄組文庫中鐵蛋白的部分序列信息，設(shè)計目的基因RACE引物，3’ RACE引物5’ -ATGTTGAAACCGAGGCTGGAATCAACCG-3，和 5，RACE 引物:5，-GCATGTTCACGCTCTTCGTCAGACTTGGT-3’。分別利用 3，RACE 引物和 5’ RACE 引物與接頭引物 NUP (5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’ )進行 3’ 末端和 5’末端的擴增。PCR產(chǎn)物用I. 2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR產(chǎn)物純化，再與pMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯，科學出版社，2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。菌落PCR檢測后，挑取陽性克隆進行測序，兩端序列拼接后得到cDNA全長序列，為SEQ ID NO :2，其編碼的蛋白序列為SEQ ID NO 2ο其中3’和5’末端擴增的條件如下50 μι反應(yīng)體系
Si(Si)-RACE-ReadycDNA2.5μΙ
IOxAdvantage 2 PCR buffer5.0μΙ
IOmM dNTP MixΙ.ΟμΙ
IOxUPM5.0μΙ
2μΜ 5'(3')RACE 引物5.0μΙ
50xAdvantage 2 Polymerase Mix Ι.ΟμΙ PCR-Grade Water30.5μΙ擴增所用PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec，72°C 3min，5個循環(huán)；94°C變性 30sec，70°C退火 30sec，72°C延伸 3min，5 個循環(huán)；94°C變性 30sec，65°C退火30sec, 72°C延伸 3min, 28 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0對篩選出的蝦夷貝鐵蛋白基因進行分析表明基因序列全長920 bp，包括516 bp的開放閱讀框，117 bp的5’非編碼區(qū)和287 bp的3’非編碼區(qū)，在3’非編碼區(qū)有一個加尾信號，5’非編碼區(qū)有一個鐵反應(yīng)元件IRE (圖I)。該基因編碼171個氨基酸，分子量為21.921^)，等電點為5.52。生物信息學分析顯示，該序列有鐵蛋白典型的二級結(jié)構(gòu)特征(圖2):四個長α螺旋，一個短α螺旋和一個長莖環(huán)；存在鐵氧化活性中心(Ε25，Υ32, Ε59,Ε60, Η63, Ε105, Q139)和鐵離子礦化中心(D58, Ε59, Ε62)，屬于M型鐵蛋白。實施例2 :本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白基因的重組表達本發(fā)明中的體外重組鐵蛋白制備及活性分析包括下列步驟a)重組鐵蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建；
b)重組鐵蛋白的表達；c)重組鐵蛋白的純化；d)鐵蛋白的活性分析。具體操作如下a)重組鐵蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO 2的cDNA序列，結(jié)合表達載體的多克隆位點，設(shè)計引物，其中正向引物的序列為5 ’ -CCACATATGACTGAAAGTCAACCTCGC-3，反向引物的序列為5’- GGGAAGCTTAGTCCAGGGATTTCTTGTCG -3’。以蝦夷扇貝肝胰腺cDNA為模板，進行蛋白編碼區(qū)PCR擴增，20 μ I反應(yīng)體系包含
滅菌雙蒸水10.2 μΙ
10 X PCR Buffer2 μΙ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μΙ
MgCI2 (25 mM)1.6 μΙ
正向引物(2μΜ)2μΙ
反向引物(2 μΜ)2μΙ
cDNA 模板0.5 μΙ
ExTaq 酶(5 U/μΙ) 0.1 μΙ按下列程序進行PCR 擴增，95°C變性 5 min ；94°C 30 s, 62. 8°C 30 s，72°C 2min，共35個循環(huán)；72°C延伸10 min。采用膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR產(chǎn)物純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯，科學出版社，2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選克隆進行菌落PCR檢測，而后挑取陽性克隆進行序列測定。培養(yǎng)含有目的重組質(zhì)粒的克隆，提取質(zhì)粒，用NdeI和Hind III于37°C完全酶切后，按照《分子克隆第三版》的方法將其連接到pET28a表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)測序確認表達框與SEQ ID NO. 2的序列一致。b)重組鐵蛋白的表達挑取含有目的重組質(zhì)粒的陽性克隆，接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子菌。取種子菌按I :100體積比接種于新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)至0D600約為O. 5時，在4°C靜置Ih后，加入異丙基硫代_β -D-半乳糖苷(Isopropyl-β -D-thiogalactopyr,IPTG)至終濃度I mmol/L, 15°C誘導(dǎo)表達10h。4°C 5000 rpm離心10 min,收集菌體。c)重組鐵蛋白的純化用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸菌體。采用超聲波細胞粉碎儀以320 W的功率在冰水浴下超聲(總共7min ;工作5s停IOs)破碎細菌細胞，4°C 12000 rpm離心30 min,取上清液備用。用Novagen公司Ni-NTA柱純化上清液中目的蛋白，具體操作如下將Iml 50% Ni-NTA His · Bind樹脂懸液加入到4ml制備好的細菌裂解上清液中，在旋轉(zhuǎn)混合器上200 rpm輕柔搖動混勻后，4°C結(jié)合60 min。將裂解液Ni-NTA His · Bind樹脂混合物加入下端封閉的空色譜柱中，除去柱下端封閉蓋子，讓液體自由流下。以4 mlIXNi-NTA 漂洗緩沖液 I (50mM NaH2P04,pH 8. 0,300mM NaCI,20mM 咪唑)漂洗 2 次；再以
O.5 ml IXNi-NTA 漂洗緩沖液 II (50mM NaH2P04,pH 8. 0,300mM NaCI, IOOmM 咪唑)漂洗4 次。以 0.5 ml IXNi-NTA 洗脫緩沖液(50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCI,250mM 咪唑)洗脫目的蛋白4次。取洗脫下來的目的蛋白溶液吸到透析袋中，置于IL O. 15M NaCl中，4°C透析。隔2h換一次NaCl溶液，換第三次后，過夜透析。透析完畢后，將透析袋中的目的·蛋白冷凍干燥，置于_80°C保存。通過高保真PCR技術(shù)，擴增編碼鐵蛋白成熟肽的基因片段，并將其克隆到pET28a表達載體中，在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功實現(xiàn)了原核體外重組表達。采用Nickel-NTA凝膠柱的活性回收方法，純化得到可溶性的重組鐵蛋白(圖3)實施例3 :本發(fā)明的鐵蛋白的活性分析鐵蛋白的活性分析稱取一定量目的蛋白溶解于滅菌水中，Bradford法測定蛋白含量。而后用于活性驗證。鐵氧化活性驗證根據(jù)Levi et al. (1988)方法,將O. I M硫酸亞鐵銨,4 mg/ml人拓撲轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma, Aldrich)，O. 2M醋酸鈉(pH 7· O)和20 μ g/ml純化得到的重組鐵蛋白混合，室溫反應(yīng)，10 min后再加入等體積的人拓撲轉(zhuǎn)鐵蛋白。從開始到結(jié)束的20min內(nèi)，每隔Imin記錄470nm處溶液的吸光值。結(jié)果顯示加入鐵蛋白后，溶液吸光值明顯提高，表明該表達產(chǎn)物具有鐵氧化活性，即將二價鐵離子轉(zhuǎn)化成三價鐵離子(圖4)。抑菌活性驗證將鰻弧菌培養(yǎng)至指數(shù)期，而后用MH培養(yǎng)基稀釋到IO5 CFU/ml。將20 μ 稀釋后的鰻弧菌分別加入到180μ1含有純化后重組鐵蛋白(70 Pg/ml)和180μ1不含有純化后重組鐵蛋白的MH液體培養(yǎng)基中，混勻后，28° C靜置培養(yǎng)24h。于0h，12h，24h，測定600nm處吸光值。實驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示加入鐵蛋白的培養(yǎng)基內(nèi)，鰻弧菌生長明顯受到抑制，從而在吸光度上比對照組明顯低，表明本發(fā)明篩選的鐵蛋白具有抑菌活性(圖5)。因此，本發(fā)明分離的鐵蛋白能夠用來制備水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的抗菌劑。
權(quán)利要求
1.一種蝦夷扇貝鐵蛋白，其特征在于，所述的鐵蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.如權(quán)利要求I所述蝦夷扇貝鐵蛋白，其基因⑶NA序列為SEQID NO :2。
3.—種重組載體，其特征他在于，所述的重組載體用于表達權(quán)利要求I所述蝦夷扇貝鐵蛋白。
4.權(quán)利要求I所述的蝦夷貝鐵蛋白在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蝦夷鐵蛋白基因及其應(yīng)用，本發(fā)明從蝦夷貝中分離得到了鐵蛋白基因，其蛋白序列為SEQ ID NO:1，cDNA序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明克隆了蝦夷扇貝鐵蛋白基因，并對其體外重組表達產(chǎn)物進行了鐵氧化和抑菌活性分析。研究表明本發(fā)明的蝦夷扇貝鐵蛋白不僅具有螯合鐵的功能，而且具有抑菌活性，能夠抑制貝類重要致病性細菌的生長。因此，蝦夷扇貝鐵蛋白在病害防治中具有良好的應(yīng)用潛能。
文檔編號C12N15/63GK102850449SQ20121038501
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者包振民, 張月月, 張玲玲, 胡曉麗, 陸維 申請人:中國海洋大學