本發明涉及生物技術領域，具體來說是一種無血清無蛋白細胞培養基。
背景技術：
動物細胞已被廣泛用于重組蛋白藥物和疫苗的生產，培養基是動物細胞大規模培養的關鍵技術。用傳統的培養基培養細胞，需要在傳統培養基中加入5-10％的血清。血清價格昂貴，容易被病毒和支原體感染，每批次間的質量存在差異，血清中含有大量的蛋白質，給重組蛋白細胞產品的分離純化帶來很大的困難。為了克服以上難題，科學家們對血清中各成分在細胞培養中的作用的研究發現，血清中的胰島素，轉鐵蛋白和其他生長因子是促進細胞生長的主要成分，研發出用胰島素、轉鐵蛋白和其他生長因子替代血清的無血清培養基。由于這些生長因子主要是從血清中提取或者是用基因重組技術生產的，價格昂貴，每批次間的質量也存在差異，大大地限制了此類無血清培養基的大規模生產應用。基于此，無血清無蛋白培養基的研究就成為細胞培養領域中的一項重要課題。無血清無蛋白培養基使培養基的所有成分可以完全實現使用成分界定的無動物源的化學物，保證培養基批次間的質量穩定，大大降低生產成本，簡化下游分離純化的步驟，避免外源傳染性海綿狀腦病，外源病毒和外源支原體的污染，實現大規模的生產應用。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種適合于多種不同細胞生長的無血清無蛋白培養基。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：無血清無蛋白細胞培養基，包括氨基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物的成分，所述微量元素尤其包含鋅鹽和螯合鐵。
進一步的：所述氨基酸的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的：所述維生素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的：所述無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的：所述碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的：所述微量元素中還含有以下3種鋅鹽中的任何一種或幾種：I.鹽酸鋅(ZnCl2)，II.硫酸鋅(ZnSO4-7H2O)，III.硝酸鋅[Zn(NO3)2-6H2O]，其在每升培養基中的含量分別如下:
ZnCl2 1–100μM
ZnSO4-7H2O 1–100μM
Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
進一步的：所述微量元素中還含有以下3種螯合鐵中的任何一種或幾種：I.檸檬酸鐵銨(Ferric ammonium citrate or Ammonium iron(III)citrate)，II.檸檬酸鐵(Ferric citrate or iron(III)citrate)，III.乙二胺四乙酸鐵鈉鹽(Ethylenediaminetetraacetic acid Iron(III)sodiumsalt)，其在每升培養基中的含量分別如下：
檸檬酸鐵銨 1–500mg/L
檸檬酸鐵 1–500μM
乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
進一步的：所述無血清無蛋白細胞培養基還含有脂類和脂類載體。
進一步的：所述脂類的成分及其在每升培養基中的含量如下：
膽固醇 1–20mg/L
所述脂類載體是甲基-β-環糊精，其在每升培養基中的含量為1–5000mg/L。
本發明的有益技術效果是：本發明無血清無蛋白細胞培養基所有成分都是化學界定的并且都來自無動物源的化學物。本發明無血清無蛋白細胞培養基使用后活細胞密度和細胞成活率明顯效果優異，適用于用于重組蛋白和疫苗生產的細胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細胞，可以很好的提高重組蛋白和疫苗生產的穩定性，降低生產成本，減少污染風險。
具體實施方式
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1：
無血清無蛋白細胞培養基，包括氨基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其他化學物，具體成分濃度含量如下所示：
氨基酸的成分及其在每升培養基中的含量：
維生素的成分及其在每升培養基中的含量：
無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量：
其它微量元素及其在每升培養基中的含量：
ZnCl2 1–100μM
或者ZnSO4-7H2O 1–100μM
或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
其它微量元素及其在每升培養基中的含量：
檸檬酸鐵銨 1–500mg
或者檸檬酸鐵 1–500μM
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量：
實施例2：
無血清無蛋白細胞培養基，其具體成分濃度含量如下所示：
氨基酸濃縮液：
維生素濃縮液：
無機鹽：
微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L
其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 1g/L
或者檸檬酸鐵 244.94mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 367.05mg/L
碳水化合物和其它化學物：
其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 242.23mg/L
其它化學物濃縮液：
氯化膽堿 2g/L
肌醇 500mg/L
氯化乙醇胺 100mg/L
上述實施例2中無血清無蛋白細胞培養基，其具體制備方法為:
步驟1：培養基配制，將無血清無蛋白細胞培養基的成分按照不同的組分配制成不同的濃縮液，
10倍的氨基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L
100倍其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 1g/L
或者檸檬酸鐵 244.94mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 367.05mg/L
1倍碳水化合物和其它化學物：
100倍其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 242.23mg/L
100倍其它化學物濃縮液:
氯化膽堿 2g/L
肌醇 500mg/L
氯化乙醇胺 100mg/L
步驟2：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中并混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：:用0.22μM的過濾膜除菌。
本實施例無血清無蛋白細胞培養基尤其適用于HEK293細胞，本實施例HEK293細胞在不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表1和表2。
培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(x 10E6 cells/ml)和細胞存活率(％)。
表1:
表2:
實施例3：
無血清無蛋白細胞培養基及其制備方法，具體如下：
步驟1：將無血清無蛋白細胞培養基的成分按照不同的組分配制成不同的濃縮液：
10倍的氨基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍無機鹽：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L
100倍其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 1g/L
或者檸檬酸鐵 244.94mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 367.05mg/L
1倍碳水化合物和其它化學物：
100倍其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 395.57mg/L
100倍其它化學物濃縮液:
氯化膽堿 2g/L
肌醇 500mg/L
氯化乙醇胺 100mg/L
步驟2：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中并混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：最后用0.22μM的過濾膜除菌。
本實施例無血清無蛋白細胞培養基尤其適用于CHO細胞，本實施例CHO細胞在不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表3和表4。
培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6cells/ml)和細胞存活率(％)。
表3
表4
實施例4：
無血清無蛋白細胞培養基，成分包括氨基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物，脂類和脂類載體。其具體濃度設置如下：
氨基酸的成分及其在每升培養基中的含量：
維生素的成分及其在每升培養基中的含量：
無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量：
其它微量元素及其在每升培養基中的含量：
檸檬酸鐵銨 1–500mg/L
或者檸檬酸鐵 1–500μM
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量：
脂類的成分及其在每升培養基中的含量：
膽固醇 1–20mg/L
脂類載體的成分及其在每升培養基中的含量：
甲基-β-環糊精 1–5000mg/L
本實施例無血清無蛋白細胞培養基，具體制備方法如下：
步驟1：將各成分按照不同的組分配制成不同的濃縮液：
10倍的氨基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍無機鹽：
100倍ZnCl2濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 1g/L
或者檸檬酸鐵 244.94mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 367.05mg/L
1倍碳水化合物和其它化學物：
100倍其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 680.55mg/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 121.12mg/L
100倍其它化學物濃縮液:
氯化膽堿 2g/L
肌醇 500mg/L
氯化乙醇胺 100mg/L
1000倍脂類濃縮液:
膽固醇 5g/L
1倍脂類載體：
甲基-β-環糊精 75mg/L
步驟2：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中并混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：最后用0.22μM的過濾膜除菌。
本實施例無血清無蛋白細胞培養基尤其適用于Mouse myeloma細胞，本實施例Mouse myeloma細胞在不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表5。
培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml含有1.檸檬酸鐵銨，2.檸檬酸鐵，3.乙二胺四乙酸鐵鈉鹽的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘100轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6 cells/ml)和細胞存活率(％)。
表5
無血清無蛋白細胞培養基各成分具體作用以及原理表達如下：
氨基酸：氨基酸是構成蛋白質的主要成分，同時通過氨基酸的代謝為細胞的生長提供能源。細胞培養基中的氨基酸主要包括21種，其中9種必須氨基酸：L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-纈氨酸和12種非必須氨基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-酪氨酸。由于谷氨酰胺在培養基中的不穩定性，常用相同摩爾濃度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺取代L-谷氨酰胺。CHO細胞是脯氨酸缺陷型細胞，CHO細胞的生長需要脯氨酸。由于傳統細胞培養基中的氨基酸濃度過低，傳統細胞培養基只能支持低細胞密度的貼壁培養，要支持高細胞密度的懸浮培養，必須大幅提高培養基中的氨基酸濃度，同時保證各氨基酸濃度的平衡，避免因某種氨基酸的耗盡限制細胞的生長和重組蛋白的表達。
維生素：維生素是細胞生長和代謝中許多重要酶的輔基和輔酶，細胞培養基中的維生素主要是B族維生素包括：泛酸鈣，煙酰胺，鹽酸吡哆醇，鹽酸硫胺，維生素B12，生物素，葉酸，核黃素等。
無機鹽：無機鹽對維持細胞膜的滲透壓，對營養物質通過細胞膜起著重要的調節作用。培養基中的無機鹽主要包括：Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，HPO42-，HCO3-等，其中磷是構成DNA和RNA的重要元素，HCO3-起到培養基PH的調節作用。
微量元素：微量元素是細胞生長和代謝中許多重要酶的輔基，培養基中的微量元素主要包括：Fe，Zn，Cu，Mn，Se等。
碳水化合物：碳水化合物主要是為細胞的生長提供能源，為氨基酸，DNA的合成提供前體物質，細胞培養基中的碳水化合物主要是葡萄糖。
其它化學物：培養基中還含有一些其它化學物，次黃嘌呤，胸腺嘧啶脫氧核苷是DNA補救合成途徑中的主要前體物，氯化膽堿、肌醇和氯化乙醇胺是構成細胞膜磷脂的重要成分，丙酮酸鈉和檸檬酸鈉能快速進入細胞的代謝并且對培養基起到穩定的作用，在培養基中加入葡聚糖硫酸鈉可以減少細胞在高細胞密度懸浮培養中的細胞聚團。在培養基中加入表面活性劑Kolliphor p188可以降低細胞在懸浮培養過程中所產生的剪切力對細胞的損傷。由于葡聚糖硫酸鈉和表面活性劑Kolliphor p188會降低細胞的附著(效果)能力，對于培養貼壁和附著生長的細胞，應除去無血清無蛋白細胞培養基中的葡聚糖硫酸鈉和表面活性劑Kolliphor p188。
鋅鹽和螯合鐵：血清中的胰島素和轉鐵蛋白是促進細胞生長的主要生長因子，鋅離子(Zn2+)具有調節葡萄糖代謝的功能，可以替代胰島素。螯合鐵：檸檬酸鐵銨或者檸檬酸鐵或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽能有效地把鐵離子傳遞給細胞，可以替代轉鐵蛋白。
脂類：Mouse myeloma細胞是膽固醇缺陷型細胞，Mouse myeloma細胞的生長需要膽固醇。
脂類載體：培養基中的脂類載體是甲基-β-環糊精，在培養基中加入脂類載體可以使細胞更好的利用脂類。
本發明無血清無蛋白細胞培養基使用后活細胞密度和細胞成活率明顯效果優異，適用于用于重組蛋白和疫苗生產的細胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細胞，可以很好的提高重組蛋白和疫苗生產的穩定性，降低生產成本，減少污染風險。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。