專利名稱：一種陽離子脂質(zhì)載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的非病毒基因給藥載體，具體涉及到一種新型陽離子脂質(zhì)載體及其制備方法。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，
背景技術(shù)：
上個世紀(jì)90年代，人類開展了規(guī)模宏大而意義非凡的人類基因組計劃，隨著整個計劃的完成，人類開始了自己的基因時代。人類對基因的進(jìn)一步認(rèn)識也開啟了醫(yī)藥研究的生物時代，而基因治療自然就成為了國內(nèi)外生物醫(yī)藥要研究的熱點領(lǐng)域之一?；蛑委熍c 傳統(tǒng)的療法相對有著獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其是對一些傳統(tǒng)醫(yī)藥無法治愈的遺傳性或是后天疾病，如一些惡性腫瘤或是先天性免疫性疾病。在基因治療的發(fā)展中有一個關(guān)鍵問題就是需要一種安全，高效的基因給藥載體。目前應(yīng)用于基因輸送的運(yùn)載系統(tǒng)有很多，主要分為病毒和非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)體系。病毒性載體具有轉(zhuǎn)染效率高的特點，但是病毒性載體具有很強(qiáng)的免疫原性反應(yīng)，缺乏靶向性，具有與宿主細(xì)胞潛在的整合的危險。在病毒性載體的發(fā)展中分別有三次醫(yī)療事故對病毒性載體的發(fā)展起到了很大的影響1999年在美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院發(fā)生的重組腺病毒“Jesse Gelsinger”事件；2000年在法國發(fā)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的白血病事件；2003年發(fā)生了第二例白血病誘發(fā)事件。這些事件嚴(yán)重打擊了基因治療的研究，同時也促使了研究人員對如何研發(fā)出安全有效的基因載體提出了更高的要求。在這樣的背景下，非病毒基因載體的研究逐漸成為研究的熱點。目前非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括陽離子脂質(zhì)體、聚合物、納米粒、樹突結(jié)構(gòu)和透膜性肽等。其中陽離子載體中的陽離子脂質(zhì)載體因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點一直成為科學(xué)界的研究熱點。陽離子類物質(zhì)的報道最早見于上世紀(jì)70年代，該類物質(zhì)能表現(xiàn)出很好的油水兩性。在上個世紀(jì)90年代陽離子脂質(zhì)載體的發(fā)展就取得了很好的發(fā)展，通過對多種哺乳類生物細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)陽離子載體能夠有效的轉(zhuǎn)入多種基因，而使細(xì)胞成功的表達(dá)相對應(yīng)的蛋白。陽離子類載體是由陽離子頭部，脂肪族尾部及連接臂組成的兩性物質(zhì)。頭部通常以多肽、糖脂等陽離子為主，尾部通常為脂肪族長鏈，連接臂主要以在體內(nèi)能降解的二硫鍵或酰胺鍵為主。該類化合物主要是通過靜電與DNA/RNA相互作用，將DNA/RNA壓縮聚合。以內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，形成的核內(nèi)體，由于環(huán)境pH的變化而使核內(nèi)體的結(jié)構(gòu)由膜狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榱骟w結(jié)構(gòu)，而釋放DNA/RNA產(chǎn)生作用。陽離子脂質(zhì)載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，其原因在于首先，陽離子脂質(zhì)載體作為一種PH敏感型載體，具有質(zhì)子海綿作用與親水-疏水型構(gòu)型變化作用，載體可以通過這兩種方式有效的釋放包載物。陽離子脂質(zhì)載體的頭部由于自身的結(jié)構(gòu)特點多具有兩個不同的PKa值，一個高于平均生理pH值，另外一個低于平均生理pH值。因此，陽離子脂質(zhì)體從胞外進(jìn)入到胞內(nèi)形成核內(nèi)體的過程，就是經(jīng)歷生理PH值從高到低的過程(細(xì)胞中內(nèi)吞體與溶酶體及細(xì)胞核周圍的pH值約為4. 5左右)，而這種pH的變化勢必會引起如賴氨酸或是組氨酸等易于質(zhì)子化的基團(tuán)質(zhì)子化，從而帶來核內(nèi)體膜的不穩(wěn)定，使核內(nèi)體膜的形態(tài)從在近中性的PH環(huán)境下的親水結(jié)構(gòu)層狀結(jié)構(gòu)變?yōu)樵谒嵝原h(huán)境下的疏水六面體結(jié)構(gòu)，從而釋放出包載物。對于核內(nèi)體膜會在不同pH條件下發(fā)生形態(tài)變化的直接證據(jù)，則是來源于流感病毒中的一種蛋白。該種蛋白被稱之為融合蛋白(fusogenic protein),其基本結(jié)構(gòu)融合肽(fusogenic peptide),來源于流感病毒血凝素蛋白。融合蛋白序列是一種短的、兩親性序列，在酸性PH環(huán)境中，該序列會發(fā)生構(gòu)型變化，從而使病毒逃逸出核內(nèi)體，這也是流感病毒能夠進(jìn)入人體細(xì)胞并能成功自我復(fù)制，感染細(xì)胞的原因所在。有研究表明，與常用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000相比，在同樣的實驗條件下，融合蛋白/融合肽能夠使mRAN的沉默效率提高約3. 5倍(Oliveira, S et al. IntJ Phar，2007，331 (2) ,211-2 14)。其次，載體中若是存在氧化還原勢的結(jié)構(gòu)(如二硫鍵)，同樣能夠有效的促使siRNA從核內(nèi)體中釋放。之所以含有氧化還原勢的載體結(jié)構(gòu)能夠有效的釋放包載物，是因為在包載物進(jìn)入細(xì)胞后形成的核內(nèi)體中存在著谷胱甘肽(glutathione, GSH)與硫氧還原蛋白(thioredoxin)等物質(zhì)[D. Jere, et al. BiomedMater, 2009，4 (2)，025020.]。這些酶能夠在酸性環(huán)境中有效的與載體中的相關(guān)基團(tuán)發(fā)生作用，造成Iipoplex結(jié)構(gòu)的崩解，從而引起核內(nèi)體膜的不穩(wěn)定而釋放出包載物。有研究表明含有二硫鍵結(jié)構(gòu)的D0GSDS0及CHDTAEA，在實驗條件一致的情況下，與不含類似結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑相比，其轉(zhuǎn)染效率能夠提高50倍[F. Tang, et al. BioconjugateChem, 1999，10 (5) ,791-796]。再次，載體結(jié)構(gòu)中其它一些體內(nèi)已知可降解鍵，如:酯鍵，同樣可以起到崩解Iipoplex結(jié)構(gòu)的作用，從而促進(jìn)包載物的釋放[R. H. Kallet, et al. Am.J. Respir. Crit. Care Med, 2000, 161(4 pt I)，1149-1153]。此外，陽離子脂質(zhì)載體與被包載物所形成的復(fù)合物的大小，對包載物的轉(zhuǎn)染效率有著很大影響，尤其是在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時。然而，對于到底多大的復(fù)合物對于轉(zhuǎn)染是適合的，卻沒有明確的定義。早期的研究表明，大小為200-2000nm復(fù)合物都能夠有效的轉(zhuǎn)染[P. C. Ross, et al, Gene Ther, 1999，6，651-659]。但是隨后的研究表明，小顆粒復(fù)合物(<200nm)表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)染效率[N. Yagi, et al, Cancer Res, 2009，69 (16)，6531-6538]。對于這個問題目前較為一致的看法就是復(fù)合物易于聚集，使其直徑往往>200nm;復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的異質(zhì)內(nèi)吞作用是與其大小相關(guān)的；直徑〈lOOnm的顆粒利于在毛細(xì)血管中轉(zhuǎn)運(yùn)。所以，復(fù)合物的大小較為一致的看法是處于100 - 300nm之間具有較好的轉(zhuǎn)染效率。陽離子脂質(zhì)載體之所以能夠包載核酸類物質(zhì)，就是因為兩者之間的靜電作用。但是，正是因為陽離子脂質(zhì)載體帶有正電荷，同樣使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中具有不穩(wěn)定性，從而限制了陽離子脂質(zhì)載體的應(yīng)用。具體包括以下幾點1.由于陽離子脂質(zhì)載體形成的陽離子脂質(zhì)載體表面都帶有正電荷，而在體循環(huán)中這些表面的正電荷的陽離子脂質(zhì)載體勢必會與血液中的蛋白質(zhì)或是內(nèi)皮組織相互作用，從而造成其在體循環(huán)中的快速移動產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。2.正電荷復(fù)合物通過與血液中的蛋白作用，引起血管栓塞。3.陽離子脂質(zhì)載體往往會出現(xiàn)對siRNA包載不完全的現(xiàn)象，從而致使siRNA被血清蛋白降解。正是由于上述原因，在使用陽離子脂質(zhì)載體時，尤其是在體循環(huán)中，往往與多種其它脂質(zhì)體(被稱為輔助脂質(zhì)體)按照一定摩爾比混合使用，使其成為中性脂質(zhì)體，而這種中性脂質(zhì)體往往具有很好的轉(zhuǎn)染效果。目前，常用的輔助脂質(zhì)體有N-[l-(2, 3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammoniumchloride (DOTMA) ； I,2-dioley Ioxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP)；cetyItrimethylammonium bromide (CTAB) ；dioctadecylamidoglycylapermin(DOGS)；3 β -[N-(N1 ，N' -dimethyl aminoethane)-carbamoyl]cholesterol(DC-Chol) ;l，2_dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho ethanolamine (DOPE) ；cholesterol (Chol)等等。
之所以加入這些脂質(zhì)體，除了改善復(fù)合物表面的電荷特性外，還有其它作用，諸如D0PE及類似磷脂類物質(zhì)可以穩(wěn)定復(fù)合物、增加復(fù)合物與細(xì)胞膜的相互作用、促進(jìn)包載物的釋放；膽固醇類物質(zhì)具有穩(wěn)定體循環(huán)時復(fù)合物的作用，有研究表明膽固醇可能是通過某種方式減少血清中蛋白與復(fù)合物的作用[R. Banerjee, et al, J. Med.Chem, 1999，42 (21)，4292-4299]。這也是眾多文獻(xiàn)及專利中，多應(yīng)用輔助脂質(zhì)體的原因所在。本發(fā)明的意義在于提供了一種新型陽離子脂質(zhì)載體的制備，該載體具有制備簡單，易于修飾，細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于商用轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種非病毒基因給藥載體；本發(fā)明的目的之二是提供所述的載體的制備方法；本發(fā)明的目的之三是提供所述的載體在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明設(shè)計了一種以氨基酸為骨架的兩親性陽離子脂質(zhì)體，本發(fā)明的一種陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于所述陽離子脂質(zhì)載體具有通式VI的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1. 一種陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于所述陽離子脂質(zhì)載體具有通式VI的結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于R為二硫鍵、硫原子、氧原子或是碳原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于所述的3A或A4的結(jié)構(gòu)如式XIV 或XV，其中n=0 25，m=0 25 ；
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于所述的鏈狀疏水性分子為飽和或是不飽和性脂肪族烷烴、膽固醇或如式XI所示的疏水性分子
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的陽離子脂質(zhì)載體，其特征在于所述的飽和脂肪族烷烴如式 VII所示，其中η=5 25 ；所述的不飽和脂肪族烷烴如式VIII所示，其中η=5 25，m=5 25 ;或所述的不飽和脂肪族燒烴如式IX所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不飽和脂肪族燒烴如式X所示，其中n=5 25 ；在式 VII，VIII，IX，X 中 X 為-OH、-NH2, -Cl 或-Br ；
6.一種制備權(quán)利要求I所述的陽離子脂質(zhì)載體的方法，其特征在于包括以下步驟 A.使用式I的結(jié)構(gòu)與Boc2O反應(yīng)，得到式II:
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于1A或A2的結(jié)構(gòu)式如式XII或式XIII所示， 其中n=0 25, m=0 25 ；
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于R為二硫鍵、硫原子、氧原子或是碳原子。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的3A或A4的結(jié)構(gòu)如式XIV或XV， 其中n=0 25, m=0 25 ；
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的鏈狀疏水性分子為飽和或是不飽和性脂肪族烷烴、膽固醇或如式XI所示的疏水性分子
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于所述的飽和脂肪族烷烴如式VII所示，其中n=5 25 ；所述的不飽和脂肪族烷烴如式VIII所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不飽和脂肪族燒烴如式IX所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不飽和脂肪族燒烴如式X所示，其中n=5 25 ；在式 VII，VIII, IX，X 中 X 為-0H、-NH2、-C1 或-Br ；
12.權(quán)利要求1-5任一項所述的陽離子脂質(zhì)載體在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種陽離子脂質(zhì)載體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的新型陽離子脂質(zhì)載體化合物具有通式VI的結(jié)構(gòu)，其中，3A及A4為親水性頭部，3A或A4為由一個或是多個相同或不同的氨基酸組成的親水性分子，3A與A4相同或不同；R為頭部與尾部的鏈接臂，為鏈狀或支鏈結(jié)構(gòu)；3B及B4為疏水性尾部，3B或B4為鏈狀疏水性分子，3B與B4相同或不同。本發(fā)明的新型陽離子脂質(zhì)載體化合物，具有結(jié)構(gòu)簡單、合成方便等特點。此外該化合物具有毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的特點，并且避免了合成中的繁瑣，轉(zhuǎn)染過程中也無需使用其他類型的輔助脂質(zhì)體，易于操作和使用，因此，本發(fā)明的新型陽離子脂質(zhì)載體具有潛在的商用轉(zhuǎn)染試劑開發(fā)前景。
文檔編號C12N15/87GK102925487SQ20121038504
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者楊振軍, 鄭宜, 李雅婷, 武蕓, 張禮和 申請人:北京大學(xué)