專利名稱：重組脊髓灰質炎Ⅰ型病毒樣顆粒的制備方法
技術領域：
本發明涉及重組脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經過密碼子優化的脊髓灰質炎病毒I型Pl基因和3CD基因，通過酵母表達系統制備重組脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒的方法。
背景技術：
脊髓灰質炎作為一種疾病，兩百多年前已有文字記載，1789年Underwood首次對該病進行了描述[Underwood M. A Treatise of Children with General Directionsfor anagement of Infants from Birth, 2nd ed. London:Matthews; 1789.]。從 1948 年開始，人類開始不斷確定不同脊髓灰質炎病毒株的數量，小兒麻痹癥國家基金委員會1951年報道了只有3型脊灰病毒可以引起脊灰，根據血清型分別命名為I、II、III型[Committee
on Typing of the National Foundation for Infantile Paralysis. Immunologicclassification of poliomyelitis viruses:a cooperative program for the typing ofone hundred strains. Am JHyg 54:191-274,1951]。脊髓灰質炎病毒的三種抗原類型(血清I、IIJII型)除了免疫原型不同外，其他方面都非常類似。每型的基因組序列都已完全確定，包括3種Sabin 口服脊灰疫苗株。對于脊髓灰質炎病毒來說，只有蛋白質外殼的編碼序列是獨特的，因為在自然循環中，側面的序列經常會通過與相近的腸道病毒(腸道病毒C種)重組而發生變化。脊髓灰質炎病毒普遍存在、傳染性高并具有季節性(溫帶氣候國家更明顯)，未免疫人群中幾乎所有人均可感染脊髓灰質炎病毒，脊髓灰質炎病毒感染者中少數人(小于1%)可出現麻痹癥狀，如頓挫型、非麻痹型和麻痹型脊髓灰質炎，也可引起無菌性腦膜炎。I型脊髓灰質炎病毒在3種型中最具神經侵襲性，多數脊灰流行及地方性流行病例都是由I型脊髓灰質炎病毒引起的，其次為III型和II型。傳播高峰發生在嬰兒和小年齡兒童(熱帶地區)及學齡兒童(溫帶地區)。脊髓灰質炎是人傳人疾病，通過糞-口、口- 口途徑傳播，少數情況通過共同媒介(如水、牛奶)傳播。其感染性主要在麻痹出現前及出現后f 2周，因此其傳染期可能達41周，家庭易感者或其接觸者的繼發感染率很高(可能因為糞-口傳播)，大于 90%。脊髓灰質炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae ),腸道病毒屬(Enterovirus)。其毒粒為球形正二十面體立體對稱,直徑約為27_30nm,無包膜,其核衣殼包含單股正鏈RNA基因組，約由7500個核苷酸組成。其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區，Pl區、P2區、P3區和一段3’端非編碼區。Pl區編碼病毒的主要結構蛋白，即衣殼蛋白，其轉錄及翻譯產物經蛋白酶水解后，最終得到4個蛋白產物，分別為VP4(1A)，VP2(1B), VP3 (IC)及VP4 (ID)，其衣殼結構由60個亞單位片段組成，每個片段由4種衣殼蛋白(從VPl到VP4)組成。脊髓灰質炎病毒主要的中和抗原位點位于VP1，VP2和VP3上，通過中和單克隆抗體反應模式已經確定了 4個中和抗原的位點，這樣的定位已經被高分辨率X涉嫌晶體學所證實。
脊髓灰質炎可注射滅活疫苗(IPV)或口服減毒活疫苗(OPV)預防，盡管有兩種非常有效的疫苗可以使用，脊髓灰質炎在世界范圍內仍然是重要公共衛生問題。單價OPV可以克服一些三價OPV的局限性，包括3型Sabin株之間的相互干擾。因為三價OPV中II型組分比其他組分有明顯較強的免疫原型，受種者通常II型血清首先發生陽轉。相反，單價疫苗可以根據規劃需求得到所要求的型特異性免疫應答。在發展中國家和發達國家單價OPV均表現出比三價OPV有較強的誘導型特異性免疫應答的免疫原型性。與OPV相關的主要不良反應是VAPP，其發生率是每100萬OPV服疫苗中少于O. 3個病例，即< O. 3/100萬劑；年平均VAPP的發病率為每100萬人口發生O. 14例。免疫缺陷人群發生VAPP的風險性最高，幾乎所有病例均發生在先天性或獲得性免疫缺陷患者中。最近，一個帶有歷史因素的安全性問題被提出，與OPV—樣，IPV中也含有猴病毒(SV40)，來自疫苗早期生產和使用過程中的原代恒河猴腎細胞[Butel JS, Lednicky JA. Cell and molecular biology of simianvirus 40: implications for human infections and disease. J Natl Canceer Inst91:119-134,1999]。研究表明，SV40可以使培養的細胞發生轉化，并可導致動物產生腫瘤[Dang-Tan T, Mahmud SM, PuntoniR, Franco EL. Polio vaccines, Simian Virus 40, andhuman cancer: the epideminologic evidence for a causal association. Oncogene 23:6535-6540, 2004]。根據報道，接受IPV免疫的全身性紅斑狼瘡病人中約有6%發病。病毒樣顆粒在形態上和真實的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預防性疫苗的開發提供了理想的備選方案。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒的制備方法。本發明所提供的脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒的制備方法包括如下步驟I)將脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；2)用步驟I)得到的重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細胞，分離得到重組的脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒。上述步驟I)中，所述Pl基因和所述3⑶基因均為經過密碼子優化的基因；所述優化為在不改變野生型脊髓灰質炎病毒I型Pl蛋白和野生型脊髓灰質炎病毒I型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型脊髓灰質炎病毒I型Pl基因和野生型脊髓灰質炎病毒I型3CD基因的密碼子替換為酵母細胞偏好(高頻使用)的密碼子。所述優化還包括對Pl基因序列和3CD基因序列的其他改造，以適合在酵母細胞中表達。本發明中使用的術語“偏好的密碼子”具有本領域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物體更偏愛使用某些同義三聯密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。在本發明的一個實施例中，上述步驟I)中所述Pl基因(經過密碼子優化的基因，命名為Polio I PlY)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3⑶基因(經過密碼子優化的基因，命名為Polio I 3CDY)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細胞中表達，根據本發明描述的方法對脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發明的保護范圍。上述步驟2)中，所述目的酵母細胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發明的一個實施例中，所述目的酵母細胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述Pl基因和所述3⑶基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅動轉錄，驅動所述Pl基因的啟動子方向和驅動所述3CD基因的啟動子方向相反。在本發明的一個實施例中，所述重組表達載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處得到的重組質粒，具體可將所述3CD基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點
2(MCS2/myc)的Sal I和Kpn I之間，將所述Pl基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點I (MCS1/FLAG)的 Spe I 和 Pac I 之間。
利用本發明所提供的方法制備得到的脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒也屬于本發明的保護范圍。本發明的另一個目的是提供密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因和3CD基因。本發明所提供的密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因(Polio I PlY)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；本發明所提供的密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的3⑶基因(Polio I 3⑶Y)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細胞中表達，根據本發明描述的方法對脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發明的保護范圍。其中，序列I由2646個核苷酸組成，為優化后脊髓灰質炎病毒I型Pl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列5所示的蛋白，序列5由881個氨基酸組成；序列2由1938個核苷酸組成，為優化后的脊髓灰質炎病毒I型3CD基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列6所示的蛋白，序列6由645個氨基酸組成。含有上述密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3⑶基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體可為將所述Pl基因和所述3⑶基因分別插入到pESC-URA質粒的兩個多克隆位點處，得到的重組質粒。所述重組菌可為攜帶有上述密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因的重組酵母細胞。所述酵母細胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發明的一個實施例中，所述酵母細胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述表達盒由能夠啟動所述密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因表達的啟動子，所述密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因，以及轉錄終止子組成。在本發明的一個實施例中，所述啟動子具體為釀酒酵母GALl和GALlO啟動子，當然也可以使用其他公知的酵母啟動子的任何一種，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK啟動子，或者其他真核基因啟動子。在本發明的一個實施例中，所述轉錄終止子具體為ADHl和CYCl終止子。上述密碼子優化型的脊髓灰質炎病毒I型的Pl基因或3CD基因在制備下述a)或b)中的應用也屬于本發明的保護范圍a)脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒；
b)以脊髓灰質炎病毒I型病毒樣顆粒為活性成分的預防性疫苗。本發明還涉及并提供了在重組宿主細胞中同時表達Polio I Pl蛋白和3⑶蛋白的方法，該方法包括(I)將含有編碼PoliO I Pl蛋白和3⑶蛋白的編碼基因的重組表達載體導入重組宿主細胞，如重組的酵母細胞(釀酒酵母INVSC1)。(2)在允許所述的PolioI Pl蛋白和3CD蛋白同時表達的條件下培養重組宿主細胞，如重組的酵母細胞(釀酒酵母INVSCl)。本發明對野生型的脊髓灰質炎病毒I型(Poliovirus I，Polio I )的Pl基因或3⑶基因進行了酵母細胞偏好型密碼子優化，從而提高了 Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細胞中的表達水平。在本發明中，Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細胞中同時表達，Polio I 3CD蛋白對Polio I Pl蛋白進行酶切后得到VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白(3⑶是3C的前體，由3⑶蛋白產生的3C蛋白為一種蛋白酶，可將Pl蛋白水解為VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白)。這四種結構蛋白進而自行組裝成的脊髓灰質炎病毒I型的病毒樣顆粒(Polio I VLPs)。
實驗證明，利用本發明所提供的方法，在酵母表達系統(釀酒酵母INVSC1)中成功的制備了 Polio I VLPs，本發明對Pl基因和3⑶基因的密碼子優化提高了 Polio I VLPs在酵母表達系統中的產量。所述Polio I VLPs可以用于制備基于VLP的Polio I單價預防性疫苗。


圖I為pESC-3⑶Y質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道A為15000bp DNAMarker ；泳道B為pESC-URA質粒對照；泳道C為pESC-3CDY質粒。圖2為pESC-3CDY質粒的Sal I及Kpn I酶切鑒定結果。其中，泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC_3⑶Y質粒的Sal I及Kpn I酶切鑒定結果。圖3為PESC-P1Y-3CDY質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC_3CDY質粒對照；泳道C為pESC_PlY_3CDY質粒。圖4為PESC-P1Y-3CDY質粒的SpeI及Pac I酶切鑒定結果。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道 B 為 pESC_PlY_3CDY 質粒的 SpeI 及 Pac I 酶切鑒定結果。圖5為Western Blot鑒定重組Polio I衣殼蛋白的表達。其中，泳道A和泳道D為蛋白分子量對照；泳道8為INVSCl/pESC-PlY-3CDY蛋白提取物(實驗組);泳道C為PolioI陽性對照蛋白(陽性對照)AIdtE為INVSCl/pESC-URA酵母蛋白提取物(空載體對照)。圖6為通過透射電鏡技術顯現的Polio I病毒樣顆粒(VLPs)的代表樣品(實驗組待測樣品)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例UPolio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的密碼子優化及全基因合成以下按分步驟詳細描述Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的密碼子優化及全基因合成的流程。
UPolio I Pl基因和Polio I 3CD基因的密碼子優化根據野生型Polio I Pl基因序列(如序列表中序列3所示，該基因命名為Polio I PlW)和野生型Polio I 3⑶基因序列(如序列表中序列4所示，該基因命名為Polio I 3CDW)，經過設計和反復驗證得到適合于在酵母細胞中表達的優化型Polio I Pl基因序列和優化型Polio I 3⑶基因序列，即將Polio I病毒的Pl基因序列和3⑶基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉變成含有如Sharp PM等(Sharp PM, Cowe E. SynonymousCodon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991，7 (7) :657-678.)所描述的酵母優選密碼子的優化序列，從而提高Polio I Pl蛋白和Polio I 3⑶蛋白在酵母細胞培養環境中的表達水平。根據上述方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設計的優化型Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因，分別命名為Polio I PlY和Polio I 3⑶Y，其基因序列分別為序列表中 序列I和序列2。Polio I PlY基因(序列I)編碼的蛋白與序列3所示野生型Polio I Pl基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列5所不氣基酸序列組成的蛋白；Polio I 3CDY基因(序列2)編碼的蛋白與序列4所示野生型Polio I 3CD基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列6所示氨基酸序列組成的蛋白。2、密碼子優化型Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的全基因合成使用序列重疊延伸PCR法全基因合成Polio I PlY和Polio I 3⑶Y，具體方法如下根據優化Poli0 I PlY和Polio I 3⑶Y的基因序列合成多條IOObp的上下游片段，兩片段間3’端互補重疊15bp，所述上下游片段互為模板、引物進行PCR擴增，使用凝膠回收試劑盒回收擴增片段，再以此相鄰的回收片段互為引物、模板進行下一輪PCR擴增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物進行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互為模板、引物進行PCR拼接，依此類推最終合成全長的密碼子優化型Polio I Pl基因和Polio I 3CD 基因，即 Polio I PlY 和 Polio I 3CDY。實施例2、攜帶Polio I 3⑶Y和Polio I PlY的酵母重組表達載體的構建I、大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備從37°C培養16 20h的新鮮平板上挑取DH5a單菌落(Takara公司，產品目錄號為D9057S)，接種于5ml不含抗菌素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜(12 16h)。次日從上述培養物中吸取O. 5ml按體積比1:100轉入50ml LB培養基中繼續培養約3h，至菌液的0D600值為3時，在無菌條件下將細菌轉移到一無菌、用冰預冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清,將管倒置Imin,使殘留培養液流盡，以IOml用冰預冷的IOOmM的CaCl2溶液重懸細菌沉淀，冰浴30min。4°C, 4000rpm離心IOmin,棄上清，每50ml初始培養物用2ml預冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重懸細菌沉淀，分裝成200 μ I每管，_80°C保存備用。2、pESC-URA 質粒的轉化用無菌吸頭分別吸取I μ g pESC-URA質粒(一種具有雙向啟動子的酵母表達質粒，購自Angilent technologies，產品目錄號為217454)加入200 μ I上述步驟I制備的DH5 α感受態細胞中，輕輕旋轉混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉移到冰浴中，使細胞冷卻I 2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培養基(蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購自北京欣經科公司，NaCl購自國藥化學試劑有限公司)，將管轉移至37°C搖床上，溫育45min (轉速<150rpm)。取50 μ I已轉化的感受態細胞，用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應抗生素的LB平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養12 16h。3、pESC-URA質粒的小量制備挑取經上述步驟2轉化培養所得的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜。將培養物移入I. 5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30_60s，倒去培養液，倒置離心管，使上清流盡，用100 μ I預冷的溶液I (終濃度為50mmol/L的葡萄糖，終濃度為25mmol/L的Tris-HCl，終濃度為10mmol/L的EDTA，pH8. O)重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ I新鮮配制的溶液II (終濃度為O. 2mol/L的NaOH，終濃度為質量百分含量1%的SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預冷的溶液IIK配制IOOml溶液III 5mol/L KAc 60ml,冰乙酸 11. 5ml,水 28. 5ml)溫和混勻，冰浴 IOmin, 12000rpm 離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室溫晾干后,用30 μ I含 RNaseA (100μ g/ml)的 TE (pH 8.0)溶解沉淀，37°C水浴 3(T60min 后置 _20°C保存備用。4、酵母重組表達載體pESC-3CDY的構建將實施例I得到的Po I i ο I 3⑶Y基因克隆到pESC-URA質粒的多克隆位點2(MCS2/myc)的SalI和Kpn I之間，得到酵母重組表達載體pESC_3CDY。具體按照如下步驟進行I)將實施例I得到的Polio I 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’端分別引入限制性內切酶Sal I和Kpn I (限制性內切酶Sal I及Kpn I購自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點。具體操作如下以實施例I得到的Polio I 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內切酶Sal I和Kpn I酶切位點的Polio I 3⑶Y基因片段上游引物為5’ -ACGCGTCGACACCATGGGTCCAGGTTTTGATTATGC-3’ (下劃線處為限制性內切酶Sal I酶切位點的序列，該序列的第 14-36 位為序列 2 的第 1-23 位);下游引物為 5’ -GGGGTACCTTAAAAAGAATCCAACCATC-3>(下劃線處為限制性內切酶Kpn I酶切位點的序列，其后的序列為序列2的第1919-1938位的反向互補序列)。2)使用限制性內切酶Sal I和Kpn I酶切上述步驟3制備的pESC-URA質粒，回收骨架載體(大片段，由于小片段大小僅約為45bp，瓊脂糖凝膠電泳時經常無法顯示)與經同樣酶切的Polio I 3⑶Y基因片段按摩爾比I :5的比例混合，依次加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(T4DNA連接酶及10XT4DNA連接酶緩沖液購自大連寶生物工程有限公司)，反應體積為20μ 1，16°C連接過夜，取10 μ I連接反應產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從接種轉化產物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到4ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜，按步驟3所述質粒的快速小量制備方法提取重組質粒(圖I)。并用內切酶SalI及KpnI對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定結果如圖2所示，得到大小約為6600bp和2000bp的兩個條帶，與預期結果相符，進一步經酶切鑒定后的重組質粒送公司測序，將測序證實含有Polio I 3⑶Y基因的重組質粒命名為pESC-3⑶Y。5、酵母重組表達載體PESC-P1Y-3CDY的構建將實施例I制備的所述Polio I PlY基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達載體pESC-3CDY的多克隆位點I (即為pESC-URA質粒的多克隆位點1，MCSI/FLAG)的SpeI和Pac I之間，得到酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y。具體按照如下步驟進行I)將實施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)的5’端和3’端分別引入限制性內切酶Spe I和Pac I (限制性內切酶Spe I及PacI購自紐英倫生物技術北京有限公司)的酶切位點。具體操作如下以實施例I得到的Polio I PlY基因(如序列表中序列I所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內切酶Spe I和Pac I酶切位點的Polio I PlY某閔片段h.游引物為5’_GGACTAGTACCATGGGTGCTCAAGTTTCTTC-3 ’ (下劃線處為限制性內切酶Spe I酶切位點的序列，該序列的第12-31位為序列 I 的第 1-20 位)；下游引物為 5’ -CCTTAATTAAGGTTAATAAGTAGTCAAATCT-3，(下劃線處為限制性內切酶Pac I酶切位點的序列，該序列的第13-31位為序列I的第2628-2646位的反向互補序列)。2)使用限制性內切酶Spe I和Pac I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達載體pESC-3⑶Y，回收骨架載體(大片段)與經同樣酶切的Polio I PlY基因片段按摩爾比I :5的比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)，依次·加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應體積為20 μ 1，16°C連接過夜，取10 μ I連接反應產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從接種轉化產物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到4ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜，按步驟3所述質粒的快速小量制備方法提取重組質粒(圖3)。并用內切酶Spe I及Pac I對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定結果如圖4所示，得到大小約為8600bp和2600bp的兩個條帶，與預期結果相符，進一步經酶切鑒定后的重組質粒送公司測序，將測序證實含有Polio I PlY基因的重組質粒命名為PESC-P1Y-3CDY。酵母重組表達載體pESC_PlY_3CDY中，啟動所述PolioI PlY基因轉錄的啟動子為釀酒酵母GALlO啟動子，轉錄終止子為ADHl終止子；啟動所述Polio I 3⑶Y基因轉錄的啟動子為釀酒酵母啟動子GAL1，轉錄終止子為CYCl終止子。實施例3、重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化I、釀酒酵母感受態細胞的制備在釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落INVSc KSaccharomyces cerevisiae,產品目錄號C81000，購自Invitrogen)接種于IOml YPD培養液(購自北京欣經科公司)中，30°C振搖培養16h，取合適體積的培養物加入IOml YB)培養液中混勻，使其0D600值為O. 4，30°C振搖培養6h后0D600值為O. 9,將培養物轉入50ml無菌的離心管中，室溫1500rpm離心5min,棄上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit (購自 Invitrogen)中的溶液 I (試劑盒自帶)重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min,小心棄上清,用Iml溶液II (試劑盒自帶)重懸沉淀，50 μ I/管分裝滅菌的I. 5ml離心管中，置_70°C保存。2、酵母重組表達載體PESC-P1Y-3CDY轉化酵母感受態細胞將4 μ I實施例2制備的酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y加入到上述步驟I制備的酵母INVSCl感受態細胞中，加入500 μ I Sc EasyComp transformation kit (購自Invitrogen)中的溶液III，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻，得到DNA/酵母混合物。將DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取100 μ I涂布URA選擇平板(選擇性培養液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura營養缺陷培養基粉末(Sigma公司，Y1501) 1.92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20% (w/v)葡萄糖。)，置30°C孵箱中倒置培養2_4天。隨機挑取5個單克隆菌落接種于IOml URA選擇培養液中，30°C振搖培養16h，離心收集酵母細胞。將經過上述鑒定表明成功轉入重組表達載體PESC-P1Y-3CDY的酵母INVSCl細胞命名為INVSCl/PESC-P1Y-3CDY。同時設置轉入pESC-URA空載體的酵母INVSCl細胞的對照，將該酵母細胞命名為INVSCl/pESC-URA ;設置轉入PESC-P1W_3CDW載體的酵母INVSCl細胞的對照，將該酵母細胞命名為 INVSCl/pESC-PlW-3CDW (pESC_PlW_3CDW 載體與 pESC_PlY_3CDY 載體相t匕,將其Polio I PlY基因替換為Polio I PlW基因，將Polio I 3CDY基因替換為PolioI 3CDW 基因)。3、重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化I)重組Polio I病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達將經過上述步驟2獲得的 INVSCl/pESC-PlY-3CDY (實驗組)、INVSCl/pESC_PlW_3CDW (野生型對照組)和 INVSCl/pESC-URA (空載體對照組)單菌落分別接種于50ml URA選擇培養液(選擇性培養液(Ura_):YNB 6. 7g，酵母Ura營養缺陷培養基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20% (w/v)葡萄糖。)中，30°C振搖培養16h， 取合適體積的培養液接種于500ml URA選擇培養液中，使0D600值為O. 4，30°C振搖培養4h，取合適體積的培養液接種3L URA誘導培養液(YNB 6. 7g，酵母Ura營養缺陷培養基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g,溶于800ml去離子水中，高壓滅菌,冷卻至50°C,加入IOOml無菌的20% (w/v)半乳糖和IOOml無菌的20%麥芽糖)，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養48h，離心收集菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，APV高壓均質儀以1500bar循環破碎3次，4°C 8000g離心15min，收集上清(破碎菌液上清)，置-70°C保存。將I倍體積的50%PEG溶液(50%PEG溶液50g PEG6000 (Ameresco公司)溶于100ml ddH20)緩慢加入到4倍體積的上述破碎菌液上清中，4°C攪拌過夜。第二日，4°C 8000rpm，30min離心，去除上清，收集沉淀。用無菌PBS重懸沉淀，濃縮至樣品原體積的1/10，得到濃縮樣品。2)重組Polio I病毒樣顆粒的純化在離心管中由下至上依次小心加入I. 4g/ml、I. 32g/ml和I. 2g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步驟I)中得到的濃縮樣品)置CsCl不連續密度梯度(CsCl購自北京欣經科公司)，4°C用BeckmanSW32Ti轉頭IOOOOOg離心21h，PBS緩沖液重懸沉淀，4°C 13000g離心15min，收集上清液置_70°C保存，得到待測樣品。對純化后的待測樣品通過BCA法(BCA蛋白濃度測定試劑盒購于海門市碧云天)進行蛋白產量測定，結果顯示利用本發明所提供的密碼子優化后的重組表達載體PESC-P1Y-3⑶Y (實驗組)，在酵母表達系統中，每升發酵液可以制備得到約1-1. 5mg的重組Polio I病毒樣顆粒，遠高于野生型對照組，而空載體對照組沒有包裝出重組Polio I病毒樣顆粒。這一結果說明，密碼子優化有效的提高了 Polio I病毒樣顆粒在酵母表達系統中的產量。實施例4、重組Polio I病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察I、Western Blot鑒定重組Polio I衣殼蛋白的表達利用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒(增強型)(P0010S)，按照說明書操作步驟，對實施例3得到的純化后的待測樣品(實驗組待測樣品或空載體對照組待測樣品)進行蛋白定量。根據定量結果，對三種待測樣品各取適量的懸液(保證三種樣品的上樣蛋白總量相等)進行10%SDS-PAGE電泳。用識別Polio I、II、111全蛋白的羊多克隆抗體為一抗(一抗購自ProSci，產品目錄號為35-341)，熒光標記兔抗羊抗體為二抗(二抗購自KPL，產品目錄號為072-07-13-06)進行Western Blot分析(蛋白Marker購自Fermentas公司，產品目錄號為SM0671)。同時設置脊髓灰質炎病毒I型sabinl株(poliovirus sabinlstrain) (AKIO N0M0T0, TOSHIKO OMTA, HARUKA TOYODA, et al. Compelte nucleotidesequence of the attenuated poliovirus Sabin lstrain genome. Prac. Natl. Acad.Sci.，1982(79) :5793-5797.)為陽性對照。結果如圖5所示，實驗組待測樣品和陽性對照樣品均檢測到大小約為27KD (VP3)的Polio I特異性條帶，且實驗組(密碼子優化后)所檢測到的Polio I特異性條帶與陽性對照條帶一致；而空載體對照組待測樣品未檢測到Polio I的特異性條帶。2、重組Polio I病毒樣顆粒的電鏡觀察將實施例3得到的純化后的三個待測樣品(實驗組待測樣品或空載體對照組待測樣品)調整蛋白濃度一致，各取10 μ I懸液滴加在覆蓋鍍碳支持膜上靜止lmin，吸干鍍碳支持膜(購自中鏡科儀，編號BZ110223)表面殘余液體，用2%磷鎢酸(購自中鏡科儀，編號GZ02536)染色lmin，吸干鍍碳支持膜表面殘液，室溫放置干燥后用透射電子顯微鏡觀察其形態結構。結果顯示，實驗組待測樣品(圖6)可見直徑約30nm左右的病毒樣顆粒的存在。而空載體對照組待測樣品則沒有在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的存在。本實施例的結果表明，攜帶有密碼子優化后的Polio I Pl基因和Polio I 3⑶基因的重組表達載體在酵母系統中，成功的包裝出Polio I的病毒樣顆粒。
權利要求
1.脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟 1)將脊髓灰質炎I型的Pl基因和3CD基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體； 2)用步驟I)得到的重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細胞； 3)裂解步驟2)得到的重組酵母細胞，分離得到重組的脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因均為經過密碼子優化的基因；所述優化為在不改變野生型脊髓灰質炎I型Pl蛋白和野生型脊髓灰質炎I型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型脊髓灰質炎I型Pl基因和野生型脊髓灰質炎I型3CD基因的密碼子替換為酵母細胞偏好的密碼子。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述目的酵母細胞為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅動轉錄，驅動所述Pl基因的啟動子方向和驅動所述3CD基因的啟動子方向相反。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處各由一個啟動子驅動轉錄得到的重組質粒。
7.利用權利要求1-6中任一所述方法制備得到的脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒。
8.密碼子優化型的脊髓灰質炎I型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；和/或 密碼子優化型的脊髓灰質炎I型的3CD基因，其特征在于所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
9.含有權利要求8所述Pl基因和/或3CD基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
10.權利要求8所述Pl基因和/或3CD基因在制備下述a)或b)產品中的應用 a)脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒； b)以脊髓灰質炎I型病毒樣顆粒為活性成分的預防性疫苗。
全文摘要
本發明公開了重組脊髓灰質炎Ⅰ型病毒樣顆粒的制備方法。本發明所提供的方法包括如下步驟1)將脊髓灰質炎Ⅰ型的P1基因和3CD基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；2)用所述重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述P1基因和所述3CD基因的重組酵母細胞；3)裂解所述重組酵母細胞，分離得到重組的脊髓灰質炎Ⅰ型病毒樣顆粒。實驗證明，利用本發明所提供方法，在酵母表達系統中制備了脊髓灰質炎病毒Ⅰ型的病毒樣顆粒，同時較野生型P1基因和3CD基因相比，本發明對P1基因和3CD基因的密碼子優化大大提高了脊髓灰質炎病毒Ⅰ型的病毒樣顆粒在酵母表達系統中的產量，可將其進一步用于生產嬰幼兒手足口病候選預防性疫苗和藥物組合物。
文檔編號C12N1/21GK102876688SQ20121039094
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者盛望, 王曉雯, 趙淼, 張瀟, 曾毅, 李澤琳, 劉偉 申請人:北京工業大學