一種Sabin株脊髓灰質炎III型病毒單克隆抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種Sabin株脊髓灰質炎Ⅲ型病毒的單克隆抗體及其應用，屬于免疫學領域。本發明將Sabin株脊髓灰質炎Ⅲ型病毒免疫接種小鼠后，將鼠脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選產生抗Sabin株脊髓灰質炎Ⅲ型病毒的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC No.9233，其分泌的單克隆抗體效價高，中和活性強，能在體外有效阻斷Ⅲ型脊髓灰質炎病毒的感染；同時抗體可以特異性的區分Ⅲ型與Ⅰ、Ⅱ型脊灰病毒以及其他多種腸道病毒，特異性好，可用于制備脊髓灰質炎病毒Ⅲ型抗原含量檢測試劑盒和抗體檢測試劑盒，也可以用于Ⅲ型脊髓灰質炎病毒的鑒別檢測，具有廣泛的應用領域與前景。
CGMCC No9233
20140526
【專利說明】-種Sabin株脊髓灰質炎I I I型病毒單克隆抗體及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫學領域與疫苗學領域，具體地，涉及一種抗Sabin株脊髓灰質炎 III型病毒的中和性單克隆抗體及產生該抗體的雜交瘤細胞株以及抗體的應用。

【背景技術】
[0002] 脊髓灰質炎疾病早在公元前1580-1350時期就存在于人類社會中，最早的證據來 源于古埃及石壁畫中一個呈站立姿態的人物，具有明顯的脊髓灰質炎疾病癥狀：腿部彎曲 萎縮，腳面畸形。然而，直到1789年，英國人Michael Underwood才首次描述了脊髓灰質炎 疾病的臨床癥狀，稱之為"下肢衰弱"。半個世紀后，德國人的研究表明脊髓灰質炎疾病可 能具備傳染性。1894年在美國爆發了有記載以來最大規模的嬰兒癱瘓災難，后來被證實罹 患的是脊髓灰質炎疾病。1908年澳大利亞醫生Karl Landsteiner和Erwin Popper首次 提出了假說，認為脊髓灰質炎疾病是由一種病毒引起的。隨后在美國流行的疫情更加速了 人們對疾病傳播的研究。直到1931年Macfarlane Burnet和Jean MacNamara首次解釋 了三種脊髓灰質炎病毒（后稱脊灰病毒），即I、II和III型。上述三種病毒導致脊髓灰質炎 (poliomyelitis)疾病，該疾病是一種傳播廣泛、侵犯中樞神經系統的傳染病。感染脊灰病 毒的患者中有90%沒有臨床癥狀或只有很輕的臨床癥狀。這些癥狀包括發燒、頭疼、嘔吐、 疲勞、脖頸僵直、四肢疼痛等。在每200名受感染的患者中會有一位產生不可逆的癱瘓，部 位主要集中在腿部。更為嚴重的癱瘓癥狀可以延伸到患者的軀干，包括胸部和腹部肌肉的 麻痹，最為嚴重的癥狀是當脊灰病毒侵染腦部細胞后造成中樞呼吸系統的破壞，導致吞咽 和說話的困難。有5-10%的患者因為呼吸肌麻痹導致死亡。脊髓灰質炎疫苗（包含I、II、 III型的脊髓灰質炎病毒）是預防脊髓灰質炎疾病的有效手段。
[0003] 自1988年實施消滅脊髓灰質炎（脊灰）戰略以來，我國通過接種口服脊髓灰質炎 減毒活疫苗（OPV)消滅了本土野毒株引起的脊髓灰質炎。但是仍存在OPV引起的疫苗相關 麻痹病例（VAPP)和疫苗衍生株（VDPV)，脊髓灰質炎滅活疫苗（IPV)基本可避免OPV上述缺 點。WHO指出當全球證實消除脊灰后，將停止使用0PV，屆時可能需要脊髓灰質炎滅活疫苗 (IPV)來長期保持脊灰免疫水平。相對于野毒株IPV，Sabin株IPV在制造和使用過程中更 安全，對它的研究受到了 WHO的高度重視。目前生產脊髓灰質炎減毒株滅活疫苗的國家有 中國、日本及荷蘭。
[0004] 如上所述，根據抗原決定簇不同脊髓灰質炎病毒可分為I、ΙΙ、ΠΙ型三個血清型， 任何一型病毒造成的疾病都稱為脊髓灰質炎。I型易引起癱瘓，也最容易引起流行。三個 型別的病毒間中和試驗無交叉反應。每種脊髓灰質炎病毒均有兩種抗原，D(致密）抗原和 C(無核心）抗原。前者存在于成熟的、有感染性的病毒顆粒中，是脊髓灰質炎病毒的中和抗 原，具有型特異性。C抗原存在于經過56°C滅活，或者未成熟的空心病毒顆粒中，是一種耐 熱的抗原成份，與三個型別的脊髓灰質炎病毒的抗血清均呈補體結合陽性反應。D抗原含量 反應完整的病毒抗原顆粒的多少，是體外測定IPV效力的關鍵指標，與疫苗在人體內的免 疫效力有較好的一致性。脊髓灰質炎病毒抗體是指動物或人體抗脊髓灰質炎各型別病毒產 生的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應用于脊髓灰質炎病毒鑒定、脊髓灰質炎疫苗以及 各型別抗原的定性和定量檢測中。
[0005] 由于目前III型病毒抗原檢測普遍采用的多抗包被--多抗夾心的檢測體系，該體 系對于I、II型存在較大的交叉反應，尤其在用于三型混合疫苗Sabin株IPV的III型抗原 檢測時，由于交叉反應導致檢測結果不能真實反應III型抗原的含量以及疫苗III型的免疫原 性，同時WHO也推薦采用多抗與單抗匹配的方式檢測三價脊灰疫苗中的各型抗原含量；目 前國際上尚缺乏Sabin株IPV D抗原檢測的標準化的試劑，制備特異性好，具有中和活性的 單克隆抗體，可為Sabin株IPV體外效力檢測方法的標準化奠定基礎。因此，有必要制備一 種型特異的脊髓灰質炎III型單克隆抗體，用于III型脊灰抗原、抗體的檢測與病毒的鑒別。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種Sabin株脊髓灰質炎III型病毒的中和性單克隆抗體， 用于III型脊灰病毒抗原含量的檢測。
[0007] 本發明的另一目的在于提供上述單克隆抗體的應用。為了達到上述目的，本發 明首先提供一種分泌Sabin株脊髓灰質炎III型病毒的中和性單克隆抗體雜交瘤細胞株 SVASIPV-III，于2014年5月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編 100101)保藏，分類命名為Sabin株脊髓灰質炎III型單抗雜交瘤細胞株，保藏編號CGMCC No.9233〇
[0008] 本發明提供了保藏編號為CGMCC No. 9233的雜交瘤細胞株在制備預防或治療脊髓 灰質炎藥物中的應用。
[0009] 本發明還提供了由上述雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。
[0010] 具體而言，本發明采用小鼠骨髓瘤細胞雜交瘤技術制備Sabin株脊髓灰質炎III型 病毒的中和性單克隆抗體，通過以下技術方案實現：通過將免疫脊髓灰質炎病毒原液的小 鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，分離出能夠分泌脊髓灰質炎抗體的單克隆雜交瘤細胞，接種 小鼠腹腔，制備含有特異性脊髓灰質炎III型病毒抗體的腹水，經過后期處理并驗證，得到特 異性好、抗體水平高且能長期保存的Sabin株脊髓灰質炎III型病毒單克隆抗體。
[0011] 進一步，本發明提供了一種Sabin株脊髓灰質炎III型病毒單克隆抗體，其由保藏 編號為CGMCC No. 9233的雜交瘤細胞株分泌獲得。
[0012] 更進一步地，本發明提供了上述單克隆抗體在制備檢測脊髓灰質炎III型病毒抗原 試劑盒中的應用。
[0013] 本發明提供了上述的單克隆抗體在制備檢測脊髓灰質炎III型病毒抗體試劑盒中 的應用。
[0014] 本發明提供了一種用于檢測脊髓灰質炎III型病毒抗原或抗體的試劑盒，含有上述 單克隆抗體。
[0015] 對本發明的單克隆抗體，經生物標記或化學標記后獲得的的單克隆抗體也屬于本 發明的保護范圍。
[0016] 進一步地，經酶標記的單克隆抗體屬于本發明的保護范圍。
[0017] 所述的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
[0018] 上述單克隆抗體不進行生物標記或化學標記，而添加第二抗體；即采用一種物種 的抗脊灰抗體包被酶標板，添加脊髓灰質炎III型病毒抗原后，加入本發明單抗，然后加入抗 屬二抗HRP，用于檢測或制備檢測試劑。
[0019] 本發明提供了一種可以用于脊髓灰質炎治療性抗體的改造的細胞株，以及包含于 細胞株的保護性抗體的基因信息。
[0020] 進一步，本發明提供了一種使用Sabin株脊髓灰質炎III型病毒直接免疫動物制備 多克隆抗體和單克隆抗體的全新模式，收獲液的免疫效果優于常規的疫苗原液添加佐劑的 免疫效果，可以為其他病毒制備抗體提供參考，因此采用Sabin株脊髓灰質炎III型病毒收 獲液免疫小鼠制備雜交瘤細胞。
[0021] 所述脊髓灰質炎病毒Sabin株III型收獲液的制備方法為：取Vero細胞工作細胞庫 復蘇后培養，至細胞濃度為〇. 1-10 X IO6細胞/ml時，接種病毒；取III型病毒制備的工作種 子批毒種按MOI = 10?0. 05接種Vero細胞或其他原代、傳代細胞，然后進行培養；病毒培 養后收獲細胞上清，即為脊髓灰質炎病毒Sabin株III型病毒收獲液。
[0022] 本發明提供的Sabin株脊髓灰質炎III型病毒單克隆抗體具有如下有益效果：
[0023] 1、本發明的單克隆抗體具有較高的效價即反應性，間接法效價最高可達106。
[0024] 2、本發明的單克隆抗體具有較高的中和效價，可以有效反映脊髓灰質炎III型病毒 有效抗原表位，用于抗原含量檢測優于多抗--多抗的檢測體系；同時該單抗反映的中和 表位即有效抗體，可用于抗脊髓灰質炎IgG抗體競爭法檢測，用于疫苗免疫效果的評價及 流行病學調查，更加有效的評價疫苗的免疫效果及地區的過往發病史。
[0025] 3、本發明的脊髓灰質炎III型單克隆抗體可以特異性的區分脊髓灰質炎野毒株I、 Π 型病毒，不與其反應，是能夠與sabin株脊髓灰質炎III型病毒特異性結合的單抗。
[0026] 4、本發明的單克隆抗體與甲肝病毒、腸道病毒71型病毒、柯薩奇A16病毒等無交 叉反應，均有較好的病毒特異性。
[0027] 5、單克隆抗體可廣泛應用于脊髓灰質炎病毒的檢測、鑒別、篩查與疫苗生產的抗 原檢測以及流行病調查中；同時檢測的是抗原決定簇，可以更加有效的反應疫苗的有效組 分，對疫苗的工藝研究與生產具有重要意義。

【具體實施方式】
[0028] 以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0029] 本發明實施例中選用的Sabin株脊髓灰質炎III型病毒來自荷蘭Intravacc，代次 RS0+2(S0+6)代，但毒株不限于本來源與本代次的毒株。若未特別指明，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；實施例中所用的試劑為市售商品。
[0030] 實施例ISabin株脊髓灰質炎III型病毒免疫原制備與動物免疫
[0031] (1)取Vero細胞工作細胞庫復蘇后于36. 5±0. 5 °C培養，至細胞濃度為 0. I-IOXlO6細胞/ml時，接種病毒。
[0032] (2)取Intravacc來源的sabin株脊髓灰質炎III型病毒制備的工作種子批毒種按 MOI = 10 ?0· 05 接種 Vero 細胞，置 32. 5±0· 5°C培養。
[0033] (3)病毒培養2?4天，收獲細胞上清，即為脊髓灰質炎病毒Sabin株III型病毒收 獲液。
[0034] (4) III型收獲液澄清后用超濾膜包濃縮5倍以上。
[0035] (5)然后進行分子篩層析和離子交換層析，監測波長為280nm，分別收集洗脫液和 流穿液，即得純化液，甲醛滅活后即得III型疫苗原液。（6)將疫苗原液與弗氏佐劑（0天免疫 為弗氏完全佐劑，14天、28天免疫為弗氏不完全佐劑）等體積混合乳化后于0天、14天、28 天背部皮下多點免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/只。III型病毒收獲液于0天、14天、28天背部皮 下多點免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/只。
[0036] (7)末次免疫一周后采血檢測抗體效價，血清稀釋IO4時收獲液免疫小鼠血清的間 接ELISA的OD值為1. 532,原液加佐劑免疫小鼠血清的間接ELISA的OD值為0. 237,收獲 液免疫小鼠血清效價高于疫苗原液加佐劑免疫小鼠，確定采用收獲液免疫小鼠進行細胞融 合篩選單抗。于末次免疫二周后采用收獲液腹腔沖擊選定的小鼠，3天后取小鼠脾臟，進行 細胞融合。
[0037] 實施例2細胞融合及建株
[0038] (1)細胞融合前復蘇培養SP2/0細胞株，融合前3天擴大培養，融合前1天去除 RPMI 1640細胞培養液（Gibco)，重新添加培養液，準備SP2/0細胞。
[0039] (2)處死免疫小鼠，按常規方法制備小鼠脾細胞懸液。
[0040] (3)根據脾細胞與SP2/0細胞計數結果分別加入適量不完全IMDM培養液 (Gibco)，SP2/0細胞晃動混勻，脾細胞用移液管吹打均勻。然后將脾細胞與SP2/0細胞按 1:2?10:1混合于50ml離心管中，混勻。
[0041] (4)加不完全MDM培養液至50ml，離心5-10分鐘，倒凈上清。輕擊融合管底，使 沉淀細胞松散均勻，離心管置37°C水浴，準備融合。
[0042] (5)將37 °C預熱的50%的PEG4000lml，用滴管緩慢滴入混合細胞管，邊滴邊轉動 離心管，使細胞保存在混勻狀態。
[0043] (6)靜置90s后立即緩慢加入15ml無血清的MDM培養基（Gibco) (37°C )，然后離 心5-10分鐘，棄去上清。
[0044] (7)加入頂DM完全培養液（Gibco)，混勻，將混懸液分別加至96孔細胞培養板中， 100μ 1/孔，于37°C，5% (：02培養箱內培養。
[0045] (8)第 2 天細胞板加 HAT 培養液（MDM 含 1*HAT (Sigma)) 100 μ 1/ 孔。
[0046] (9)每2-3天換一次HAT培養液，觀察是否出現雜交瘤，兩周后換HT培養基（IMDM 含1*的HT (Sigma))，觀察融合細胞生長狀況。
[0047] (10)細胞融合后第七天開始觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10 以上時吸出上清進行抗體ELISA檢測。將陽性孔細胞轉入24孔板擴大培養，及時做亞克隆。
[0048] (11)經3次亞克隆得到穩定分泌抗體的細胞系，命名為SVASIPV-III，凍存細胞。 將雜交瘤細胞株進行保藏，保藏號CGMCC NO. 9233,分類命名為：Sabin株脊髓灰質炎III型 單抗雜交瘤細胞株，保藏時間：2014年5月26日；保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理 中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京 市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0049] 實施例3單抗細胞株腹水制備與抗體效價檢測
[0050] 按常規方法將凍存的實施例2獲得的雜交瘤細胞進行復蘇，培養，待細胞覆蓋 25ml的細胞培養瓶瓶底50%以上時即可按照常規方法腹腔接種BALB/c小鼠，定期收集腹 水 SIPV-III。
[0051] 將脊髓灰質炎III型疫苗原液采用0. OlM PBSl: 20稀釋，100 μ 1/孔包被酶標板， 2-8°C過夜，檢測脊髓灰質炎III型腹水SIPV-III的抗體效價，抗體效價為106,效價較高。結 果見表1。
[0052] 表1抗體效價檢測結果
[0053]

【權利要求】
1. 一種分泌Sabin株脊髓灰質炎III型病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏編號為 CGMCC No. 9233。
2. 由權利要求1所述雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
3. 權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測脊髓灰質炎III型病毒抗原試劑盒中的應 用。
4. 權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測脊髓灰質炎III型病毒抗體試劑盒中的應 用。
5. -種用于檢測脊髓灰質炎III型病毒抗原的試劑盒，其特征在于，含有權利要求2所 述的單克隆抗體。
6. -種用于檢測脊髓灰質炎III型病毒抗體的試劑盒，其特征在于，含有權利要求2所 述的單克隆抗體。
7. 根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，為經生物標記或化學標記的單克 隆抗體。
8. 根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，為酶標記的單克隆抗體。
9. 權利要求1所述的雜交瘤細胞株在制備預防或治療脊髓灰質炎藥物中的應用。
10. -種制備權利要求1所述雜交瘤細胞株的方法，其特征在于，采用Sabin株脊髓灰 質炎病毒III型病毒收獲液免疫小鼠，所述Sabin株脊髓灰質炎病毒III型病毒收獲液的制備 方法為：取脊髓灰質炎III型病毒制備的工作種子批毒種按M0I = 10?0. 05接種Vero細胞 或其他原代、傳代細胞，接種病毒時的細胞濃度為〇. 1-10x 106細胞/ml,病毒培養后收獲細 胞上清，即為Sabin株脊髓灰質炎病毒III型病毒收獲液。
【文檔編號】C12N5/20GK104371980SQ201410549841
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】江志華, 童欽, 金亞明, 王欣, 程會欣, 王一丁, 姜德玉, 蔡芳, 高強, 尹衛東 申請人:北京科興生物制品有限公司