專利名稱：棉花GhTCP2基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及棉花GhTCP2基因啟動子及其組織特異性表達(dá)模式的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉花(Gossypium Hirsutum)作為全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其纖維是人類紡織業(yè)的主要原材料。與此同時，棉花的種子和油料也是人們?nèi)粘Ｉa(chǎn)生活中不可或缺的優(yōu)良資源，在畜牧業(yè)和柴油生產(chǎn)方面發(fā)揮著重要作用。但是，棉花病蟲害很多，尤其是蟲害，直接影響棉花產(chǎn)量。其中，棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。該蟲是中國棉區(qū)蕾鈴期害蟲的優(yōu)勢種，近年為害十分猖獗，搞好棉鈴蟲的預(yù)測預(yù)報及綜合防治顯得十分重要。
TCP2基因隸屬于TCP轉(zhuǎn)錄因子家族，最早發(fā)現(xiàn)的TCP家族成員包括玉米teosintebranched I (TBI )基因、金魚草的cycloidea (CYC)基因和水稻PCFl，PCF2基因，這三個成員的英文縮寫首字母組即位該家族名稱的由來。TCP轉(zhuǎn)錄因子蛋白成員有獨(dú)特的二級結(jié)構(gòu)，其中部含有一個約60個氨基酸組成的保守的DNA結(jié)構(gòu)域(TCPdomain),形成一個非典型的喊性螺旋 _ 環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)[non-canonicalbasic-Helix-Loop-Helix (bHLH) structure]，可能參于蛋白質(zhì)的二聚化和與DNA結(jié)合的功能。研究進(jìn)展表明，TCP家族成員主要在植物的花器官、葉腋、頂端分生組織、腋芽等快速生長的部位表達(dá)，這一現(xiàn)象表明，TCP家族可能在細(xì)胞分裂和生長發(fā)育中起著重要的作用。蟲害是影響棉花產(chǎn)量的重要因素之一，棉鈴蟲主要取食棉花的嫩葉和棉蕾。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉攜帶的Bt基因能有效抑制棉鈴蟲侵害。目前市場上銷售的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Bt基因是由花椰菜病毒的35S啟動子驅(qū)動的，該啟動子在植物各個組織都有表達(dá)，使得不被棉鈴蟲取食的其他組織或器官過量表達(dá)異源Bt基因，可能對棉花的生長發(fā)育，抵御生物和非生物脅迫的能力造成影響。本發(fā)明涉及的GhTCP2啟動子可以取代目前市場上廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉花中的花椰菜病毒的35S啟動子，讓抗蟲基因Bt在棉鈴蟲取食的主要部位表達(dá)，降低了抗蟲基因?qū)D(zhuǎn)基因棉花除抗蟲能力外的其他能力的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供棉花GhTCP2基因啟動子序列、其組織特異性表達(dá)模式及應(yīng)用。本發(fā)明提供棉花GhTCP2基因啟動子，其具有I) SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2) SEQ ID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明提供含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體。在本發(fā)明的實(shí)施例中，含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體為pBI121_GhTCP2。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有棉花GhTCP2基因啟動子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明提供了棉花GhTCP2基因啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了棉花GhTCP2基因啟動子在植物組織中表達(dá)模式的應(yīng)用。其中，所述的植物組織為腋芽或花蕾。其中，所述的表達(dá)模式為表達(dá)抗蟲基因。 其中，所述的植物為擬南芥、水稻或棉花。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(I)本發(fā)明提供了棉花GhTCP2基因啟動子(核苷酸序列如SEQID No. I所示)及其在植物腋芽及花蕾中組織特異性表達(dá)模式。(2)通過轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-Ο，并進(jìn)行⑶S染色，發(fā)現(xiàn)GhTCP2在植物腋芽和花蕾中特異表達(dá)(擬南芥、水稻、棉花等)，有望對為在棉花幼嫩的棉鈴中表達(dá)抗蟲基因提供特異的啟動子，以提聞棉花的抗蟲能力。


圖I為GhTCP2基因棉花不同部位半定量PCR結(jié)果。圖2為含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體圖譜。圖3為含有棉花GhTCP2基因啟動子的載體酶切驗(yàn)證結(jié)果；其中I為空載體pBI121用EcoRV和BamHI雙酶切的酶切結(jié)果；2為pBI121_GhTCP2載體用EcoRV和BamHI雙酶切酶切結(jié)果舊代表博邁德生物技術(shù)有限公司Ikb DNA ladder。圖4為棉花GhTCP2基因啟動子驅(qū)動⑶S基因轉(zhuǎn)化擬南芥后⑶S染色結(jié)果，其中
I.在擬南芥幼苗中表達(dá)；2.在幼嫩的根尖部分表達(dá)；3.在整個花器官中都有表達(dá)；4.在葉腋處表達(dá)；5.花器官放大后,發(fā)現(xiàn)在幼嫩的花蕾中表達(dá)量較強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。實(shí)施例I棉花GhTCP2基因啟動子的獲得本發(fā)明的GhTCP2基因啟動子是采用Genome Walking法從市場上購得的陸地棉(Gossypium hirsutum)品種新陸早13號中克隆得到的。將本實(shí)驗(yàn)室之前擴(kuò)增獲得的GhTCP2基因中間保守序列(其序列如SEQ ID No. 2所示)、5’ RACE和3，RACE側(cè)翼序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接得到的序列設(shè)計引物GhTCP2ProSPl、GhTCP2ProSP2和GhTCP2ProSP3。以棉花基因組總DNA為模板，用Genome Walking Kit同種AP引物進(jìn)行3次巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因啟動子區(qū)。將IstPCR反應(yīng)液稀釋1000倍后，取I μ L作為2nd PCR反應(yīng)的模板，配制2ndPCR反應(yīng)液。取2nd反應(yīng)液稀釋1000倍后，取I μ L作為3rdPCR反應(yīng)的模板，配制3rdPCR反應(yīng)液。分別用試劑盒中提供的四種AP引物進(jìn)行三次巢式PCR反應(yīng)，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。操作步驟如下(I)配制 1st PCR 反應(yīng)液
權(quán)利要求
1.棉花GhTCP2基因啟動子，其特征在于，其具有1)SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求I所述基因啟動子的載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其為pBI121-GhTCP2。
4.含有權(quán)利要求2或3所述載體的宿主細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求I所述基因啟動子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I所述的基因啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的基因啟動子在植物組織中表達(dá)模式的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述的植物組織為腋芽或花蕾。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述的表達(dá)模式為表達(dá)抗蟲基因。
10.如權(quán)利要求7-9任一所述的應(yīng)用，所述的植物為擬南芥、水稻或棉花。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花GhTCP2基因啟動子及其應(yīng)用。所述的棉花GhTCP2基因啟動子序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GhTCP2基因啟動子在植物(擬南芥、棉花等)的腋芽和花蕾中特異表達(dá)，可為在棉花腋芽和花蕾中特異性表達(dá)抗蟲基因提供啟動子，減小抗蟲基因在其他組織表達(dá)對棉花產(chǎn)生的負(fù)面影響，在不影響棉花產(chǎn)量的前提下，提高棉花的抗蟲能力。
文檔編號C12N15/63GK102943075SQ20121039233
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者李學(xué)勇, 邢進(jìn), 趙金鳳, 劉偉娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所