蚯蚓生物復合酵素的制作方法
【專利摘要】蚯蚓生物復合酵素，取一定量的活蚯蚓，用超聲波清洗機清洗，盡最大可能使其內臟中的污物排出，然后撈出濾去多余水分，稱重。取900公斤蚯蚓加入生物反應器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發酵48小時，將濾出液進行超濾，濃縮有效成份，進入真空冷凍干燥機，在升華溫度不高于30℃條件下，干燥約4-10小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。
【專利說明】蚯蚓生物復合酵素
【技術領域】:
[0001]本發明屬于食品及生物制藥領域。
技術背景: [0002]現代醫學研究證明蚯蚓有清熱、鎮定、抗驚厥、平喘、抗組胺、降血壓、溶栓、抗癌的功效。蚯蚓蛋白質含量很高，約占鮮蚯蚓的8 %~10 %，干重的56 %~66 %，氨基酸以谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的含量居多。蚯蚓凍干粉和體腔內液脂肪酸含量分析表明，不飽和脂肪酸含量高，飽和脂肪酸含量低。特別是具有抗癌、降血壓、防止動脈硬化、養顏等作用的亞油酸含量更高，而十三羧酸明顯不同于別的動物，這些符合當前人類健康食品結構的要求。
[0003]蚯蚓富含核酸、VA、Vc, VE等功能因子，Fe、Mn、Cu、Zn、Se等微量元素豐富，它們與其他中藥材中有機物絡合發揮更大藥理功效，其中Se還能促進細胞免疫作用。此外，蚯蚓尚含蟲丘蝴素(Iumbritn)、蟲丘蝴堿(Iumbrofobrim)、蟲丘蝴毒素(terrestrolumbrolysin)以及嘌呤、膽堿、膽甾醇等主要特殊活性物質。然而，目前研究得最多的是蚯蚓的幾種酶(系)。
[0004]一、蚯蚓酶系及生理功能
[0005]1、纖溶酶(fibrinolytic enzyme)
[0006]蚯蚓作為活血化淤的藥材已有幾千年歷史。新鮮蚯蚓體內含的纖溶酶即屬于其中一組具強烈溶解纖維蛋白及血栓作用的絲氨酸蛋白酶，可從不同種屬的蚯蚓分離得到。
[0007]2、蝴激酶(Iumbrinonase)
[0008]蚓激酶是從蚯蚓中提取的一種絲氨酸蛋白酶，具有典型的胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶的多肽鏈折疊形式，與纖維蛋白原有特異的親和力，且具有纖溶活力。蚓激酶能明顯降解纖維蛋白原，降低血小板聚集率及血液粘度。現已有很多研究證明蚓激酶在體外具有強的纖溶活性，從而使其可能成為一種很有應用前景的溶栓制劑。
[0009]3、抗腫瘤蛋白
[0010]謝江碧等以赤子愛勝蚓為原料，分離得到一組抗腫瘤活性蛋白成分(簡稱蚯蚓抽提物)。祖殉等選取赤子愛勝蚓為原料，研究了通過各種方法分離出的樣品對于腫瘤細胞的抑制作用。結果表明分離純化后某一蛋白組分可有效抑制BEL-7402細胞(人原發性肝癌細胞系)、HeLa細胞(人宮頸癌細胞系)的生長。
[0011]4、溶血素
[0012]從蚯蚓體腔液中可以分離到具有溶血活性的蛋白質，其中個別蛋白質為雙功能蛋白質，具有溶解和凝集紅細胞的活性。
[0013]5、消化酶
[0014]蚯蚓在有機殘體轉化和土壤養分循環中起著重要的作用，為明確不同生態類型蚯蚓的食性及其消化有機物質的能力，張寶貴等測定了表居型蚯蚓赤愛勝蚓(Eiseniafetida)和上食下居型蟲丘蝴威廉環毛蝴(Pheretima guillemi)腸道內纖維素酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性；同時還對威廉環毛蚓排泄物中蛋白酶、磷酸酶以及C02呼吸強度與原土進行了比較，結果表明，赤愛勝蚓腸道內纖維素酶活性遠遠高于威廉環毛蚓，而蛋白酶和酸性及堿性磷酸酶活性顯著低于威廉環毛蚓；兩種蚯蚓腸道消化酶活化的差異與赤愛勝蚓直接以植物殘體為食，而威廉環毛蚓以半分解的有機殘體上的微生物為食有關。而且得出不同種類的蚯蚓生活習性不同，食性不同，體內成分也存在差異。
[0015]6、抗菌肽
[0016]張希春等采用硫酸銨沉淀，超濾，陽離子交換分離和反相快速蛋白質液相色譜(FPLC)分析，得到了兩種新的蚯蚓抗菌肽F-1與F-2，經電噴霧離子源質譜(ES1-MS)測定，其相對分子質量為535.27和519.27，串聯質譜(MS/MS)數據表明F-1的肽序列為 190Ac-Ala-Met-Val-Ser-Se;r, F-2 的妝序為 Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr,最小抑菌濃度(MIC)實驗表明，F-1與F-2對鵓雞腸球菌Ginterococcus gallinarum)、綠膿桿菌(Pseudomonas pyocyanea)、鮑氏不動桿(Acinetobacterbaumanii)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)的最小抑菌濃度分別為11.4mg/L和12.85mg/L,對幾腸球菌(Enterococcus faecalis)的最小抑菌濃度分別為22.8mg/L和25.68mg/L,對真菌白色鏈株菌(Candidaalbicans)沒有表現為完全的抑制作用。
[0017]7、鈣結合蛋白
[0018]張燕紅等以赤子愛勝蚓為材料，通過DEAE-FastFlow離子交換層析、CaM-Sepharose親和層析,分離純化得到Φ丘蝴鈣調素結合蛋白(CaMBPs)。王采療等以赤子愛勝蚓為材料分離純化了鈣調素，并得到一種新的鈣結合蛋白。王立波等應用紅外光譜技術定量測定了水化膜中蚯蚓新鈣結合蛋白(NCBP)的二級結構及在不同比例Ca2+、Tb3+離子的作用下其二級結構的變化。結果表明，NCBP中a-helix含量較低而β-sheet的含量較高，且隨不同比例全局離子的加入，1629cm_l處β-sheet峰的變化較明顯。同時發現，NCBP具有鈣結合蛋白家族特征的SDS-PAGE現象，但不具有激活PDE靶酶的活性，初步認為，NCBP含有與Ca2+濃度相關的特殊的結構和功能。另外，高濃度下Tb3+的結合引發NCBP的分子間聚合。提示對稀土元素的使用要慎重。
`[0019]8、過氧化氫酶
[0020]徐煒虹等以赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)組織勻漿經硫酸胺鹽析、透析濃縮后，用大柱制備和電泳純化得到兩個過氧化氫酶，均為糖蛋白，分子量分別為39kD和40kD，KCN及Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+等金屬離子均抑制酶的活性，Pb2+、Fe2+則有激活作用。在直隸環毛蟲引(Pheretima tschiliensis)體內實驗中，Zn2+顯著提高過氧化氫酶的總活力，Cd2+、Ν?2+先是降低，隨后提高酶總活力。
[0021]9、膽堿酯酶
[0022]丁詩華等對赤子愛勝蚓的TritonX-1OO抽提液經PEG2000-磷酸鉀緩沖液處理、離子交換層析及凝膠過濾后，獲得電泳純的膽堿酯酶，該酶經鑒定為糖蛋白，凝膠過濾法和SDS-PAGE法測得其Mt分別為59000和58000，酸性氨基酸含量約占24%，堿性氨基酸含量約占12%，最大紫外吸收λ = 272nm;酶作用最適溫度T = 39°C，熱穩定性較差；最適pH為7.8，在pH7.0-8.0酶較穩定，對碘化硫乙酰膽堿的Ka值為88 μ mol/L,有過量底物抑制現象.Mg2+、Ca2+和Mn2+對酶活性的影響較小。DEP則對該酶有強烈抑制作用。
[0023]10、蚯蚓素
[0024]陳可夫等通過實驗表明，蚯蚓素9203對小鼠無鎮痛、鎮靜作用；對大鼠原位腸無抑制作用，對大鼠心電、血壓、呼吸頻率和呼吸深度均無明顯影響。個別大鼠出現異常情況，可能與蚯蚓素9203不純有關；對豚鼠離體回腸有一定抑制作用，以后在臨床應用中有可能產生便秘的副作用，提醒臨床醫生給予密切關注。總的看來，蚯蚓素9203作為溶栓新藥很有研究如景。
[0025]二、蚯蚓酶目前常用的提取工藝
[0026]1、過去常用的提取工藝
[0027]通常蚯蚓酶的提取方法是鹽析，繼而用多種層析及HPLC、FPLC乃至親和層析、或離子交換、分子篩、凝膠電泳等手段從不同品系的蚯蚓中獲得多種蚯蚓酶的單純組分，但操作麻煩，流程長，且酶活力損失很大，又不適合工業化生產。
[0028]2、近期新的提取工藝
[0029]新提取方法一:
[0030]提取工藝描述:取一定量的活蚯蚓，水洗數次，盡最大可能使其內臟中的污物排出，然后撈出用濾紙盡量吸其多余水分，稱重，加2倍體積的緩沖液于勻漿器中勻漿5分鐘，在4°C冰箱中靜置4小時后，高速離心，棄去沉淀，取上清液加固體硫酸銨達一定飽和度，以4000r/min,離心IOmin,收集上清液再加入固體硫酸銨達較高的飽和度,靜置過夜,高速離心，收集沉淀，然后用緩沖液溶解此沉淀物，用透析袋透析去鹽或用超濾方法濃縮后，用冷凍干燥機凍干。此時為淡棕色粉末狀物質，是酶的粗制品。
[0031]新提取萬法二:
[0032]提取工藝描述:選用純正赤子愛勝(大平二號)成蚓，篩除漂洗各種雜質，并浙干污水。洗凈的蚯蚓加入一定濃度鹽水，在組織勻漿器中高速勻漿5分鐘后，低溫靜置鹽析沉淀，經鹽析后高速離心，收集上清液。沉淀用鹽溶液洗滌兩次，再離心，收集上清液，合并上清液，進行第一次超濾，以濾除不溶于水的大分子。將濾出液再次超濾，濃縮有效成份。當濃縮液達5% -10%濃度后，進入真空冷凍干燥機，在升華溫度不高于30°C條件下，干燥約5-20小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。

【發明內容】
:
[0033]蚯蚓生物復合酵素是利用生物技術提取的蚯蚓全部酵素。
[0034]一.主要設備:
[0035]超聲波清洗機，蚯蚓生物反應器，超濾設備，真空冷凍干燥機
[0036]二，工藝流程
[0037]酵素菌+助劑
[0038]活蚯蚓超聲波清洗機清洗蚯蚓生物反應器濾出液超濾設備真空冷凍干燥機粉碎包裝
[0039]三，生產描述:
[0040]取一定量的活蚯蚓，用超聲波清洗機清洗，盡最大可能使其內臟中的污物排出，然后撈出濾去多余水分，稱重。取900公斤蚯蚓加入生物反應器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發酵48小時，將濾出液進行超濾，濃縮有效成份。進入真空冷凍干燥機，在升華溫度不高于30°C條件下，干燥約4-10小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。
[0041]四，產品及工藝特點[0042]1，使用酵素菌生物技術，加速蚯蚓溶解，酵素產量大幅提升。
[0043]2，工藝設備簡單。
[0044]3，不使用硫酸銨，鹽等化學助劑
[0045]4，除清洗外， 不用水，使濃縮干燥更容易。
【權利要求】
1.蚯蚓生物復合酵素是利用生物技術提取的蚯蚓全部酵素。 取900公斤蚯蚓加入生物反應器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發酵48小時。
【文檔編號】C12N9/00GK103740657SQ201210393076
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年10月17日 優先權日:2012年10月17日
【發明者】李大治 申請人:沈陽尊龍生物技術有限公司