專利名稱：甘蔗黃銹病菌pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
甘鹿黃銹病(Sugarcane orange rust disease)屬真菌性病害，由屬于屈恩柄銹菌的甘鹿黃銹病菌引起。病原菌可經由風快速傳播,然后通過氣孔侵入，造成感病品種蔗莖產量和蔗糖分的損失。與甘蔗褐銹病不同，甘蔗黃銹病在春季更流行，適宜的環境條件更利于病害發展，例如溫暖濕潤的夏季和涼爽的秋季。甘蔗黃銹病主要危害甘蔗葉片，在葉片上產生淡黃色小斑點，后病斑在葉片正背
兩面產生長2 10 ram的橙黃色夏孢子堆，因此稱為黃銹病。危害癥狀最初較輕，病斑不明顯，隨病斑擴大，拉長的黃色病斑留下淺黃綠色暈圈，且顏色由桔色發展到橙棕色。與一般的褐銹病不同，桔色銹斑從來不會發展為暗褐色。銹病膿包在葉表成團發生，且大多發生在低層葉片表面，病斑多在葉片基部。控制甘蔗黃銹病發生的首要措施為培育和栽種抗黃銹病甘蔗品種，在此過程中，如何檢測目標甘蔗品種中是否含有甘蔗黃銹病菌以及檢測的的效率和準確性與甘蔗抗黃銹病育種的進程和效果密切相關。目前，一般采取兩種方法判斷種莖是否帶菌一種是采用分離培養技術，在建立純培養物的基礎上，根據培養物所產生孢子的形態特征進行鑒定，屈恩柄銹菌夏孢堆葉背生，長0.5 I _，表皮破裂時散出肉桂色粉狀物。夏孢子卵圓形，表面具刺，淺黃色，大小25 42X17 25 ( μ m)，壁厚I. 5 2.5 μ m，赤道上有4個芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子長橢圓形，頂端圓或平，深褐色，大小30 56X15 22 ( μ m),壁厚2 4. 5 μ m,具一隔膜，柄短，黃褐色；另一種是基于該病害表型癥狀，因為甘蔗受黃銹病菌侵染后，病害癥狀表現為黃色病斑，拉長的病斑留下淺黃綠色暈圈，且顏色由桔色發展到橙棕色，且桔色銹斑從來不會發展為暗褐色，因此，可以采用種莖種植后，觀察是否發生甘蔗黃銹病判斷待檢測甘蔗品種是否含有黃銹病菌。但是，上述的第一種方法由于分離培養以及最終建立純培養物需要時間長，加上分離過程雜菌污染等，都會影響分離效果，檢出效率不高；第二種方法則由于甘蔗、環境條件和病原菌三者之間的互作，可能導致即使種莖中存在該病原，病害也不一定會發生的現象，只有三個因素都具備，病害才能發生，因此，田間基于誘發的抗病性鑒定方法，鑒定結果難以預料，而且還存在不同地點、不同年份間的鑒定結果有較大的差異以及耗時長達幾個月等逆勢。顯然，目前已有的技術方法，對于判斷種莖是否帶菌是不適用的，急需建立一種能夠實現“快速”與“準確”目標要求的甘蔗黃銹病菌的檢測方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測。本發明的甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測，其特征在于
1、PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25μ 1，內含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25μ I ； PCR 擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 56 °C 45 S，72 °C I min，35 個循環；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；
所述檢測引物如下
PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，
PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’ ；
2、PCR擴增產物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為525bp的位置出現DNA條帶，為甘蔗黃銹病菌存在的標志。本發明的應用效果
本發明的甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實用性好、準確性高和操作簡便快速等優點。I、實用性好直接從待檢測甘蔗品種中檢測甘蔗黃銹病菌具有重要的實際應用價值。目前，在甘蔗品種及其種質資源交換過程中，甘蔗黃銹病菌的檢測方法是根據病菌培養物所產生孢子的形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定，無法滿足快速檢疫的需要。為了使我們的檢疫方法具有實際的應用價值，我們采用直接從待檢測甘蔗品種中提取DNA后直接進行PCR擴增，可在5 6小時內完成對甘蔗黃銹病菌的檢測。因此本方法大大提聞了檢測的效率。2、準確性高傳統的甘蔗黃銹病菌檢測技術是根據病原物孢子的形態特征或者根據田間種植后病害表型癥狀鑒定來確定檢疫對象，無法排除人為因素的干擾，很難區分形態相似種或容易受環境條件的影響，從而導致準確性不高；同時，形態學檢測在近緣菌內的不同種之間可區別的特征較少，有些甚至沒有什么差異，同時還需要判斷者具有豐富的知識和經驗，方可作出準確的判斷。而本發明根據甘蔗黃銹病菌的特異性序列，選擇甘蔗黃銹病菌特有的一段保守序列設計特異引物，根據變異序列設計特異性引物進行擴增比較，為病原菌的檢測和鑒定提供準確的靶標位點。經過與甘蔗黃銹病菌以及其它不同植物中近緣病原菌的比較，該引物的準確率高。3、操作簡便快速應用本發明方法，提取待檢測植株DNA、PCR擴增和常規瓊脂糖凝膠電泳即可判定檢測結果，無須對病原菌進行培養或田間種植鑒定，一般檢測過程可在5 6小時完成。本發明為甘蔗黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測體系，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測，對我國抗黃銹病甘蔗育種和抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。


圖I為使用甘蔗PCR-F和PCR-R檢測引物鑒定6個待檢測甘蔗品種是否受甘蔗黃銹病菌侵染(即是否含有甘蔗黃銹病菌)的PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；(代表以水作為模板的空白對照；P代表對應甘蔗品種中含有甘蔗黃銹病菌#代表對應甘蔗品種中不含甘蔗黃銹病菌；1_6代表6個甘蔗品種。
具體實施例方式為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說明。實施例I甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法 甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，包括以下步驟
I、基因組DNA的提取
(1)取5克待檢測甘蔗植株的葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉入50 ml的離心管中；
(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的I. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉移上清至另一干凈的I.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存備用。2、PCR檢測體系的建立
PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/LMgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F 和 PCR-R各 I. 0 μ I, I. 25U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待檢測甘蔗品種基因組DNA，ddH20補足到25 μ I。PCR擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 56 °C 45 s，72 °C I min，35 個循環；72 0C 8 min。
所述檢測引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得了甘蔗黃銹病菌的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計甘蔗黃銹病菌檢測引物。所述檢測引物PCR-F和PCR-R具體如下
PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，
PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’。3、PCR擴增產物的檢測
具體的檢測方法為，取PCR擴增產物10 μ I，加5 μ I含有溴酚藍的上樣緩沖液，混勻后點樣于含有0. 5 μ g/ml溴化乙錠的I. 5 %瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1.5 h，結束后在凝膠成像系統上成像并進行凝膠分析。PCR產物的檢測結果采用檢測引物PCR-F和PCR-R對待檢測甘蔗品種的基因組DNA進行PCR擴增，結果如圖I所示，受甘蔗黃銹病菌侵染(即含有甘蔗黃銹病菌)的樣品出現525 bp的DNA條帶，而沒有受到甘蔗黃銹病菌侵染(即不含甘蔗黃銹病菌)的樣品則不出現525 bp的DNA條帶。我們取6個待檢測甘蔗品種用PCR檢測和病原菌分離培養后的形態特征判別方法鑒定的結果進行比較，結果是一致的。如圖I所示，出現分子量為525 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經病原菌培養后的孢子形態特征鑒定均含甘蔗黃銹病菌；未出現分子量為525 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經病原菌培養后的孢子形態特征鑒定結果顯示均不含甘蔗黃銹病菌。本發明采用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ；
3、上樣緩沖液0.I %溴酚藍，40 %蔗糖；
4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。本發明所使用的儀器主要如下
1、PCR擴增儀德國Eppendorf5331 PCR擴增儀；
2、電泳儀北京六一儀器廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；
3、離心機德國Eppendorf5810/5810R多功能臺式離心機；
4、凝膠成像系統美國BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種甘蔗黃銹病菌的PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測，其特征在于 (1)PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25μ I ； PCR 擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min，56 °C 45 s，72 °C I min，35 個循環；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述檢測引物如下PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’ ； (2)PCR擴增產物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為525bp的位置出現DNA條帶，為甘蔗黃銹病菌存在的標志。
全文摘要
本發明涉及一種甘蔗黃銹病菌的PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測。本發明的甘蔗黃銹病菌PCR檢測方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實用性好、準確性高和操作簡便快速等優點。為甘蔗黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測體系，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測，對我國抗黃銹病甘蔗育種和抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
文檔編號C12R1/645GK102876798SQ20121039701
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者闕友雄, 許莉萍, 黃寧, 郭晉隆, 高世武, 羅俊, 袁照年, 陳如凱 申請人:福建農林大學