專(zhuān)利名稱(chēng)：衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)，具體涉及衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)的micoRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng){Paragonimiasis westermani)也稱(chēng)肺吸蟲(chóng),成蟲(chóng)主要寄生于人、貓、狗等肺臟里，蟲(chóng)卵隨排泄物排出體外，進(jìn)入水中發(fā)育并孵出毛蝴。毛蝴侵入第一中間宿主川卷螺，經(jīng)過(guò)胞蝴、母雷蝴、子雷蝴與尾蝴各期，尾蝴從螺體逸出后，侵入第二中間宿主石蟹或蜊蛄。體內(nèi)發(fā)育為囊蝴，人因生食含有石蟹或蜊蛄而感染。童蟲(chóng)在人體需經(jīng)移行才能到達(dá)肺臟。衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)病一般癥狀表現(xiàn)為外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多，咳嗽、咳鐵銹色痰，如果蟲(chóng)體寄生在其他部位也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。目前，該病的診斷主要是痰液涂片檢查蟲(chóng)卵 和免疫學(xué)檢查血清抗體。MicroRNAs CmiRNAs)是一類(lèi)大小長(zhǎng)約2(Γ25個(gè)核苷酸，內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RM,在許多真核生物中都曾經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。這類(lèi)RNA的功能主要是參與機(jī)體或細(xì)胞的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等過(guò)程。在寄生蟲(chóng)研究領(lǐng)域，已有研究表明寄生線蟲(chóng)存在獨(dú)特的miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，它們可以通過(guò)miRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主和自身基因表達(dá)模式的精確調(diào)控，從而提高感染和自身增殖的幾率并逃避免疫監(jiān)視。通過(guò)選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲(chóng)的發(fā)育，從而減少和阻斷寄生線蟲(chóng)的傳播途徑。衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)的miRNA有可能成為其免疫預(yù)防和化學(xué)防治的新分子靶標(biāo)，為核酸疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)micoRNA及其應(yīng)用，所述的這種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)micoRNA及其應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的抗蠕蟲(chóng)藥物造成的寄生蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，以及動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境中的藥物殘留問(wèn)題，同時(shí)提供了一種新的抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的方法。本發(fā)明一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 129所示、或者與SEQ ID NO :1 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。其中，所述互補(bǔ)的序列為DNA或RNA。進(jìn)一步的，所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過(guò)修飾的DNA或RNA，具體的，如硫代修飾或甲氧基修飾。本發(fā)明還提供了任一所述的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的組合物，含有有效量的至少一個(gè)寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明還提供了一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明所提供的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)的micoRNA均分別克隆衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，成熟的miRNA序列長(zhǎng)度為18 25 nt。對(duì)其miRNA進(jìn)行深度測(cè)序，獲得衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的miRNA表達(dá)譜，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO :1 129所示的miRNA只在衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)中表達(dá)，而在參照基因組日本血吸蟲(chóng)中不表達(dá)。因此，在衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)SEQ ID NO :1 129或采用miRNA反向互補(bǔ)序列抑制SEQ ID NO :1 129的表達(dá)將影響衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)生理功能及器官分化相關(guān)的功能。因此，本發(fā)明衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)的miRNA可用于制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)的miRNA可以選擇性的抑制或阻斷肌肉期這一特定發(fā)育期蟲(chóng)體的發(fā)育，從而減少或阻斷寄生蟲(chóng)，尤其是衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的傳播。本發(fā)明miRNA制備成為衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)疫苗時(shí)，作為核酸疫苗，避免了傳統(tǒng)抗蠕蟲(chóng)藥物造成的全球性分布的寄生蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，也不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品或環(huán)境種內(nèi)藥物的殘留。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一、miRNA的獲得
1.總RNA抽提
1)將樣本(衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)一條)放入研體中，加入少量液氮,迅速研磨,待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg組織/ml Trizol加入Trizol,轉(zhuǎn)移入離心管；
2)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無(wú)分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min ；
3)在4°C 條件下，以 12000r/min 離心 15min ；
4)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，然后在4°C條件下靜置10- 15min ；
5)在4°C條件下，以12000r/min離心15min,小心并盡可能去掉上清；
6)用ImL75%乙醇洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以12000r/min離心8min，然后小心棄去乙醇；
7)將RNA沉淀進(jìn)行干燥(不能完全干燥)處理后，用10μ L RNase - free水將RNA溶解，直接用于反轉(zhuǎn)錄。
2.總RN A純度和完整性檢測(cè)
I )純度檢測(cè)取I UL R N A樣品50倍稀釋,在BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD值，OD 260/0D 280的比值大于I. 8。2)總RNA完整性取RNA樣品I μ L，1%瓊脂糖凝膠電泳80 VX 20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA 5S rRNA, 18S rRNA和28S rRNA條帶，三條帶條帶完整。
3.small RNA序列的獲得和篩選
用15% PAGE膠回收20-30 nt的small RNA，加上5’和3’端接頭(購(gòu)自Illumina公司)后實(shí)施RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司)。產(chǎn)物經(jīng)6 %TBE PAGE膠純化后進(jìn)行Solexa測(cè)序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測(cè)序質(zhì)量差的序列(例如測(cè)序信號(hào)很低等)及長(zhǎng)度小于18 nt的序列獲得clean reads。
4.miRNA的鑒定
用 BLAST 程序(NCBI, www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)將 clean reads 與 GenBank 和Rfam database (version 9. O) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)進(jìn)行比對(duì)分析，去除非編碼RNA序列,包括rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA,和other ncRNA ;通過(guò)Repeatmasker (http: //www. repeatmasker. org)去除轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列；然后搜索 SangermiRBase (version 13. O)數(shù)據(jù)庫(kù),尋找序列相似性miRNA。將衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)所表達(dá)的miRNA與已報(bào)道的日本血吸蟲(chóng)進(jìn)行比較，分別屏蔽掉兩兩共有相關(guān)的序列，獲得衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)未注釋的miRNA。此外，為了提高反向互補(bǔ)序列的作用和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性，上述衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)特異性 miRNA的反向互補(bǔ)序列可以是DNA或RNA，還可以對(duì)反向互補(bǔ)序列進(jìn)行硫代、甲氧基等修飾。實(shí)施例2
本發(fā)明還提供了任一所述的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)miCToRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的核酸疫苗的制備采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)制備，在此不再贅述。實(shí)施例3
本發(fā)明還提供了一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的組合物，含有有效量的至少一個(gè)寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。實(shí)施例4
本發(fā)明一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。由于芯片的制造技術(shù)屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 129所示、或者與SEQ ID NO :1 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
2.如權(quán)利要求I所述的一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)miCToRNA，其特征在于所述互補(bǔ)的序列為DNA或RNA。
3.如權(quán)利要求2所述的一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)miCToRNA，其特征在于所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過(guò)修飾的DNA或RNA。
4.如權(quán)利要求3所述的一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA,其特征在于所述修飾的DNA或RNA為硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。
5.權(quán)利要求I所述的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的疫苗中的應(yīng)用。
6.一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的組合物，其特征在于含有有效量的至少一個(gè)寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
7.一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，其特征在于所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，提供了一種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO1～129所示、或者與SEQIDNO1～129中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還提供了上述的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)microRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的組合物。本發(fā)明還提供了一種基因芯片。本發(fā)明首次從衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分離獲得一類(lèi)新的miRNA，這些miRNA能影響衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的生理功能，同衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的發(fā)育，分化相關(guān)，本發(fā)明可制備用于抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的基因工程疫苗，為防治衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102888405SQ20121040211
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者陳家旭, 周曉農(nóng), 艾琳, 陳木新, 朱興全, 陳韶紅, 張永年, 李 浩, 郭儉, 田利光, 蔡玉春, 盧艷, 儲(chǔ)言紅, 陳海寧, 張玲玲, 周洋, 張加 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所