專利名稱：三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物及其制備方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease,AD)是一種常見的老年性腦神經退行性病變，發病率較高，已成為現代社會嚴重威脅老年人生命的疾病之一。其死亡率僅次于心血管病、癌癥及中風而位居第四。AD發病機制復雜，是一種多病因的疾病，典型的病理變化包括β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Αβ )沉積形成老年斑(senile plaque, SP)、神經纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFT)、基底前腦膽堿能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經元丟失及突觸形態的改變。近年來，根據AD的病因、病理及分子生物學研究進展，許多學者從不同角度提出了多種病因假說和相應的治療策略，主要有膽堿能學說、Αβ毒性作用、炎性病變、自由基氧化損傷、 腦能量代謝障礙、基因缺陷與突變等。目前臨床治療AD主要采用基于膽堿能假說即以乙酰膽堿酯酶(acetylcho-1 inesterase, AchE)為祀點的乙酸膽喊酯酶抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitors, AChEIs),包括他克林(tetra-hydroaminoacridine, THA)、多奈哌齊、利凡斯的明和加蘭他敏等藥物。這些藥物價格昂貴，具有一定的副作用，且化學合成新的藥物難度大，因而如何從天然藥物中開發AChEIs成為研究的重點。目前主要集中于中草藥及植物內生菌的代謝產物的研究，如劉平等研究了銀杏提取物(EGB)對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及海馬神經元凋亡的影響；史大華等以24味中藥為研究對象，檢測水提物對兔大腦乙酰膽堿酯酶的抑制活性；汪涯等從蛇足石杉中分離到11株具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的內生真菌。海洋來源的內生真菌抗老年癡呆的報道相對較少,而來自三疣梭子蟹的內生真菌更是未見報道。

發明內容
為了解決上述技術問題，本發明以三疣梭子蟹內生真菌一芽枝霉菌(Cladosporium sp.) Pt-2CGMCC No. 6562為研究對象，優化發酵條件，并采用有機溶劑萃取，色譜學的手段進行分離，制備對AchE抑制率達70% 90%的芽枝霉的次生代謝產物，與陽性對照他克林相比，具有顯著的抑制效果。本發明的第一個目的在于公開了一種三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物。本發明的第二個目的在于公開了上述次生代謝產物的制備方法。本發明所采用的技術方案如下一種三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2，保藏編號為CGMCC No. 6562，其18S rDNA序列如SEQ No.1所示。
一種三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物，所述次生代謝產物是通過下述方法制備所得(I)、以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌為菌種，采用液體發酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發酵培養基中發酵9天，獲得發酵物；所述發酵培養基的配方為30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KCl，0.5g MgSO4 · 7H20，O. Olg FeSO4, IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水；(2)、將發酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70 90%的次生代謝產物。上述技術方案所述的次生代謝產物，其中，AchE抑制率是以他克林作為陽性對照，通過DTNB法測定。上述技術方案所述的次生代謝產物，其中，AchE抑制率是通過DTNB法測定。三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物的制備方法，包括下述步驟(1)、以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發酵培養基中發酵9天，獲得發酵物；所述發酵培養基的配方為:30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KC1，0. 5g MgSO4 ·7Η20,0. OlgFeSO4, IgK2HPO4, 1g 酵母膏，1000mL 海水；(2)、將發酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70 90%的次生代謝產物。上述技術方案所述的制備方法，其中，AchE抑制率是以他克林作為陽性對照，通過DTNB法測定。上述技術方案所述的制備方法，其中，AchE抑制率是通過DTNB法測定。本發明所采用的三撫梭子蟹內生芽枝霉菌為芽枝霉菌(Cladosporium sp.)Pt_2,該菌種的菌學特征如下1、芽枝霉菌Pt-2菌株形態學特征如圖10所示，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形態規則，生長速度中等，培養兩天后菌落直徑為2. 3cm，菌落表面有短絨毛狀氣生菌絲，菌落中間隆起，顏色為墨綠色，最邊緣為一圈白色菌絲，生長整齊，背面呈墨綠色至黑色。2、芽枝霉菌Pt-2菌株的孢子形態特征如圖11所示的顯微鏡下(放大400倍)的孢子形態，分生孢子梗呈深色，長度不等，末端和外側可產生分生孢子，分生孢子桿形、橢圓形或檸檬形，壁光滑或輕微粗糙，單細胞伴有黑色痕跡，易散開。本發明具有以下有益效果
1、本發明通過對三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2次生代謝產物的分離和純化，獲得了 AchE抑制率達70 90%的組分，為預防老年癡呆病生物藥品的開發提供理論依據。2、本發明所制備的次生代謝產物克服了目前常用乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物價格昂貴，具有一定的副作用，且化學合成新的藥物難度大的缺點，提供了一種新的抑制乙酰膽堿酯酶活性的藥物，并提供了一種新的制備方法。


圖1為碳源對發酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖2為氮源對發酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖3為接種量對發酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖4為裝液量對發酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖5為培養溫度對發酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖6為發酵時間對發酵液提取物抑制AchE活性的影響效果柱形圖；圖7為硅膠柱層析分離流程圖；圖8為各洗脫組分對AchE抑制率的影響效果柱狀圖；圖9為反相柱和葡聚糖凝膠柱分離流程圖；圖10為芽枝霉菌Pt- 2菌的菌落形態；圖11為芽枝霉菌Pt-2菌在顯微鏡下放大400倍觀察到的孢子形態；圖12為芽枝霉菌Pt-2菌的18S rDNA片段凝膠電泳圖；圖13為芽枝霉菌Pt-2菌的進化樹。菌株保藏信息本發明芽枝霉菌Pt-2 (Cladosporium sp. Pt_2)，分類命名為芽枝霉Cladosporium sp.,已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6562，保藏日期為2012年9月11日。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對對本發明作進一步的說明。實施例1 :芽枝霉菌Pt-2 (Cladosporium sp. Pt_2)的篩選獲得一、菌株的分離1.1、培養基分離用培養基馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基，加入終濃度為200U/mL的青霉素鉀和150U/ml硫酸鏈霉素。液體發酵培養基(改良查氏培養基)30g蔗糖，3g NaNO3,0. 5g KCL, 0. 5gMgSO4 ·7Η20，0. Olg FeSO4, Ig K2HPO4依次加入IOOOmL海水中攪勻溶解，再加Ig酵母膏略加熱溶解，121°C滅菌20min備用。1. 2、菌株分離方法將蟹去殼，取其腮和腸胃部位，先用75%酒精浸泡5min進行表面消毒，然后剪碎加3mL無菌水研磨,涂布于分離培養基上,將平板放置于恒溫培養箱中，28°C倒置培養。待平板長出菌絲時，采用菌絲尖端切割法對內生真菌進行分離純化，將純化好的真菌轉于斜面，于4°C冰箱保存備用。1. 3、發酵培養將分離得到的內生真菌接種到裝有200mL查氏培養基的錐形瓶中，置于振蕩培養箱中培養14天。培養條件為28°C，120rpm。發酵結束后，發酵液進行過濾，上清液用乙酸乙酯萃取，所得萃取相采用旋轉蒸發儀蒸發、濃縮得提取物。提取物采用DTNB法測定其抑制乙酰膽堿酯酶的活性.二、菌株的鑒定1、方法1.1、菌株形態鑒定將保藏的菌種于PDA平板中培養，觀察菌落形態特征及產孢情況。菌落特征主要包括菌落的形狀、大小、顏色、隆起、表面狀況、質地、光澤等。在顯微鏡下觀察細胞的結構及孢子的形狀、著生位置、數量及排列等。1. 2、芽枝霉菌Pt-2菌株18S rDNA擴增及其序列分析(I)、基因組提取及電泳檢測①、基因組提取按照生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。②、PCR反應

PCR 體系建立(50ul)
Template (基因組)IOpmol
Primerup (IOuM)Iul
Primer down (IOuM) Iul dNTPmix (IOMmeach) Iul 10*Taq reaction Buffer 5ul Taq (5u/ul)0.25 ul
加水至50ulPCR程序設定預變性98°C 5min ;循環 95°C 35S, 55°C 35S, 72°C 40s, 35 個循環；延伸 8min。引物序列NSl 5’ GTAGTCATATGCTTGTCTC 3’NS6 5， GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3’⑵、PCR產物電泳 (3)、DNA瓊脂糖切膠純化由PCR產物電泳結果切割所需DNA目的條帶。(4)、目的片斷TA克隆包括連接反應、連接產物轉化、藍白斑篩選，具體步驟參考黃玖利，海南粗榧內生真菌S15化學成分研究[38]。(5)、質粒提取后DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。
(6)、系統進化樹的構建及分析從NCBI的基因庫中尋找與Pt-2的18S rDNA相關的序列，將相關性最高的菌株同Pt-2菌株一同構建系統進化樹，并進行同源性比較，進而確定菌株的分類。2、芽枝霉菌Pt-2菌株鑒定結果2.1、芽枝霉菌Pt-2菌株形態學特征如圖10所示的，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形態規則，生長速度中等，培養兩天后菌落直徑為2. 3cm，菌落表面有短絨毛狀氣生菌絲，菌落中間隆起，顏色為墨綠色，最邊緣為一圈白色菌絲生長整齊，背面呈墨綠色至黑色。圖11為顯微鏡下(放大400倍)觀察到的孢子形態，分生孢子梗呈深色，長度不等，末端和外側可產生分生孢子，分生孢子桿形、橢圓形或檸檬形，壁光滑或輕微粗糙，單細胞伴有黑色痕跡，易散開。2. 2、PCR產物電泳圖譜由圖12可以看出，芽枝霉菌Pt-2菌株18S rDNA片段長度為1200bp_1500bp之間。2. 3、PCR 測序結果

芽枝霉菌Pt-2菌株的18S rDNA序列如SEQ No.1所示,菌株的18S rDNA序列長1418bp，與電泳結果一致。利用Blast軟件將此序列和美國生物信息中心(NCBI)進行對比分析，結果表明與Cladosporium bruhnei strain CPC 5101相似性最高2. 4、進化樹的構建及分析應用MEGA5. 05軟件構建進化樹，結果表明芽枝霉菌Pt_2Pt_2與芽枝霉屬Cladosporium sp. 18S rDNA的相似度在99%以上,結合形態學和分子生物學的結果,最終確定該菌為芽枝霉屬，命名為Cladosporium sp. Pt_2。2. 5、發酵液的乙酸乙酯相的抑制乙酰膽堿酯酶活性從螃蟹中分離出的芽枝霉菌Pt-2具有很好的抑制AchE活性，50mg/ml的濃度下，乙酰膽堿酯酶的抑制率達到60% -80%。實施例2、三疣梭子蟹內牛芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物的制備三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物的制備過程為(I)、以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發酵培養基中發酵9天，獲得發酵物；所述發酵培養基的配方為:30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KC1，0. 5g MgSO4 ·7Η20,0. OlgFeSO4, IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水；(2)、將發酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經濃縮至干的芽枝霉菌發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70 90%的次生代謝產物。本實施例的參數通過以下方法得到一、本發明中AchE抑制率的測定方法采用DTNB法測定發酵液對AchE的抑制率，下述各步驟中抑制率的測定均采用此方法，具體步驟為將提取物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成濃度為50mg/mL的溶液。取4支IOmL的試管，試管I 4分別對應于空白組、對照組、樣品組和本底組，將4支試管放于37°C的恒溫水浴中；先向每支試管中添加乙酰膽堿碘代物20 μ L、顯色劑DTNB100 μ L和pH = 8. O磷酸緩沖液，其中試管I 4對應的pH = 8. O磷酸緩沖液體積為2950 μ L、2880 μ L、2880 μ L和2950 μ L ;然后向1、2號試管中各加入DMSOlOOy L，3、4號試管中各加入待測樣品溶液100 μ L，2、3號試管中再各加入70 μ L的乙酸膽喊酷酶后混勾；在水浴中反應4min 20s后再向各試管中分別添加40%的SDS終止劑100 μ L終止反應；最后在412nm下測其OD值，通過計算公式(一)計算出樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制率，公式權利要求
1.一種三疣梭子蟹內生芽枝霉菌pt-2抑制AchE的次生代謝產物，所述次生代謝產物是通過下述方法制備所得 (1)、以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發酵的方法，在接種量10 %、裝液量200mL/500mL三角瓶、28 V條件下在發酵培養基中發酵9天，獲得發酵物；所述發酵培養基的配方為:30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KC1，0. 5g MgSO4 ·7Η20,0. OlgFeSO4, IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水。
(2)、將發酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干； (3)、經濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70 90%的次生代謝產物。
2.根據權利要求1所述的次生代謝產物，其特征在于=AchE抑制率是以他克林作為陽性對照，通過DTNB法測定。
3.根據權利要求1所述的次生代謝產物，其特征在于=AchE抑制率是通過DTNB法測定。
4.三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物的制備方法，包括下述步驟 (1)、以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發酵培養基中發酵9天，獲得發酵物；所述發酵培養基的配方為:30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KC1，0. 5g MgSO4 ·7Η20,0. OlgFeSO4, IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水； (2)、將發酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干； (3)、經濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70 90%的次生代謝產物。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于=AchE抑制率是以他克林作為陽性對照，通過DTNB法測定。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于=AchE抑制率是通過DTNB法測定。
全文摘要
本發明三疣梭子蟹內生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產物及其制備方法，屬于生物技術領域。所述次生代謝產物是通過下述方法制備所得(1)以三疣梭子蟹的內生芽枝霉菌Pt-2為菌種，進行液體發酵，獲得發酵物；(2)將發酵液在40℃下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進行萃取，萃取液濃縮至干；(3)經濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發酵產物的有機相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個極性段，對活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進行分離，獲得AchE抑制率達70～90％的次生代謝產物。本發明具有克服了目前藥物價格昂貴，有副作用，且化學合成難度大的缺點，提供了一種新的藥物及制備方法，為預防老年癡呆病生物藥品的開發提供理論依據的優點。
文檔編號C12R1/645GK103060386SQ201210402428
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者王鳳舞, 樸美子 申請人:青島農業大學