一種封閉式培養微藻的方法
【專利摘要】本發明公開了一種封閉式培養微藻的方法。該方法包括：（1）培養兼性厭氧細菌種子液；（2）培養自養微藻種子液；（3）將兼性厭氧細菌種子液和自養微藻種子液分別接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，厭氧細菌在膜分離裝置內部發酵，微藻細胞在膜分離裝置以外的光生物反應器內進行光合作用生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充兼性厭氧細菌生長代謝所需的有機碳源。該法具有提高自養微藻收獲量，提高無機碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，簡化培養裝置等優點。
【專利說明】一種封閉式培養微藻的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種培養微藻的方法，具體地說涉及一種封閉式半混合培養自養產油微藻和兼性厭氧細菌來獲取高微藻細胞收獲量，同時提高微藻細胞油脂含量的方法。
【背景技術】
[0002]隨著經濟發展，石油資源的日益緊缺、油品供需矛盾的日漸突出，相應環境污染問題也更加突出，多渠道開發可再生資源成為必然。以微生物油脂等可再生資源為來源的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤滑性好等性能，還具有可再生、環境友好、易生物降解、儲運安全、抗爆性能好等特點，可作為石化能源的替代品。
[0003]微藻是含油微生物之一，微藻富含不飽和脂肪酸、淀粉和蛋白質等營養成分(如螺旋藻等)，可用作能源、醫藥和食品等領域原料；通過條件調控，微藻細胞可以大量積累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其體內脂肪酸含量可占細胞干重的30%~60%。利用培養微藻來積累油脂資源，已經成為目前利用太陽能和固定二氧化碳開發可再生資源最熱門的研究領域。不僅具有巨大的市場潛力，而且具有突出的社會價值。
[0004]微藻細胞生長方式一般分為光自養和碳源異養兩種，光自養過程要消耗CO2, CO2的有效利用吸收，是實現理想培養效果的關鍵，同時存在補充CO2與光合作用產生O2的解吸、排出的問題。CN200410020978.0及CN03128138.9均采用在光生物反應器系統中加入一種裝置方法，來實現CO2的補給，同時也能實現一定的氧解析效果。碳源異養過程是利用有機碳源為底物替代自養過程中的CO2來進行微藻生物質的積累，細胞生長速度較快，但細胞內油脂積累水平較低。
[0005]利用其它非藻類微生物與微藻進行混合培養的研究也比較多，CN200910038908.0公開了一種芽孢桿菌調控浮游微藻混合培養的方法，該方法在混合培養體系中使用芽孢桿菌對各微藻進行混合培養時發現，各微藻生長均衡，穩定性好，可避免混合培養體系中藻相的生物多樣性單一，避免某種微藻的數量出現極端優勢或劣勢，因此該方法主要用于控制某種微藻在水體中的泛濫。CN200910038910.8公開了一種乳酸桿菌調控微藻混合培養及協同凈化養殖排放水的方法，該方法通過乳酸桿菌的直接或間接作用，調控各種微藻的數量比例，使各藻生長均衡，穩定性好，通過菌、藻間的協同作用達到對養殖排放廢水的去氮除磷的目的。上述現有技術是通過菌體來控制水體中藻的生長均衡，并不是促進藻的生長和微藻細胞中的油脂積累。

【發明內容】

[0006]針對現有技術的不足，本發明提供一種封閉式培養微藻的方法。該法利用膜分離裝置將自養微藻與兼性厭氧細菌在封閉式光生物反應器中進行半混合培養，具有提高自養微藻收獲量，提高無機碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，簡化培養裝置等優點；同時不影響兼性厭氧細菌的發酵過程，在收獲含油微藻細胞的同時還可通過分離培養液中的厭氧發酵產品，實現細菌厭氧發酵生產化學品，是一種油脂與生物化學品同時生產的高效培養方法。
[0007]本發明封閉式培養微藻的方法,包括如下內容:
(1)培養兼性厭氧細菌種子液；
(2)培養自養微藻種子液；
(3)將兼性厭氧細菌種子液和自養微藻種子液接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，厭氧細菌在膜分離裝置內部發酵，微藻細胞在膜分離裝置以外的光生物反應器內進行光合作用生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充兼性厭氧細菌生長代謝所需的有機碳源。
[0008]本發明方法中，所述的光生物反應器還包括導流筒，膜分離裝置內置于光生物反應器導流筒內，出口與光生物反應器出口平齊。膜分離裝置優選采用陶瓷膜分離裝置，膜孔直徑為 0.05 u m ~0.5 u m。
[0009]本發明方法中，兼性厭氧細菌包括芽孢桿菌、梭形桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌或克雷伯氏菌等，有機碳源為葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纖維素水解液等，兼性厭氧細菌的代謝產物，即兼性厭氧細菌發酵產物一般為1，3-丙二醇和/或有機酸等，不同的兼性厭氧細菌得到的發酵產物有所不同，根據兼性厭氧細菌的種類不同而有所不同。兼性厭氧細菌種子液培養是本領域技術人員熟知的方法，如采用攪拌式生物反應器，加入培養基和兼性厭氧細菌，在適宜的條件下進行培養。
[0010]本發明方法中，自養微藻包括小球藻、葡萄藻、小環藻、硅藻等，自養微藻種子液培養是本領域技術人員熟知的方法，如采用常規的氣升式光生物反應器進行種子液培養。
[0011]本發明方法中，封閉式半混合培養過程中，兼性厭氧細菌種子液與微藻種子液的初始接入體積比為1:1~1:10。半混合培養的初始培養基采用兼性厭氧細菌所需的培養基，同時添加微藻細胞生長所需的無機鹽和微量元素(如按SE培養基的組成添加相關物質)等。封閉式半混合培養過程以批次或連續等方式補充兼性厭氧細菌發酵過程所需有機碳源。
[0012]本發明方法中，封閉式半混合培養條件一般采用與兼性厭氧細菌發酵過程的條件相似的條件，如溫度一般為20°C~37°C，pH值一般為6~9，優選為6.5~7.5等。
[0013]本發明方法對兼性厭氧細菌和微藻細胞進行封閉式半混合培養，兼性厭氧細菌與微藻細胞生長條件和所需碳源的不同，互相補充和促進。微藻細胞利用兼性厭氧細菌發酵后廢棄碳源(CO2)為自身生長碳源，同時維持系統較平穩的滲透壓條件(pH值)，通過補充有機碳源保證兼性厭氧細菌不斷生長，而微藻通過光條件和厭氧細菌發酵產生的二氧化碳使微藻細胞不斷生長，兼性厭氧細菌與微藻細胞通過膜分離裝置實現各自單獨的生長空間，培養基組成則是實現共混與互通，從而實現兼性厭氧細菌與微藻細胞的半混合培養過程。選擇適宜種類兼性厭氧細菌和適宜種類微藻細胞，通過控制兼性厭氧細菌和微藻細胞的培養過程，使兩者形成穩定的半混合培養體系，并建立起不同細胞間共同利用環境營養條件而細胞間不互相干擾的生長關系，實現了含油微藻的高效生長過程，并提高了油脂的累積效果，提高了單一含油微藻培養過程中單位發酵體系內的油脂收獲量，從而為微生物油脂的制備奠定了基礎。同時對兼性厭氧細菌的發酵過程不存在影響，可以同時獲得所需的發酵產物。微藻對發酵過程使用的碳源和發酵產物均具有耐受性，不影響微藻的生長和油脂的積累。與兩種微生物同步混合培養過程相比，微藻生物質收獲簡單，避免與細菌細胞一起收獲，而影響藻泥油脂提取部分的效能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發明一種具體工藝流程示意圖。
[0015]其中:1-兼性厭氧細菌種子，2-微藻種子，3-兼性厭氧細菌種子液培養反應器，4-微藻種子液培養反應器，5-兼性厭氧細菌種子液接種管線，6-微藻種子液接種管線，7-膜分離裝置，8-封閉式光生物反應器，9-混合培養基及酸堿中和劑進入管線，10-導流筒，11-進氣口，12-尾氣出口。
【具體實施方式】
[0016]本發明利用膜分離裝置封閉式培養微藻的方法，具體包括如下內容:半混合培養之前，兩種微生物分別單獨進行種子液培養，采用攪拌式生物反應器進行兼性厭氧細菌種子液培養，采用光生物反應器進行自養微藻種子液培養，攪拌式生物反應器內包括兼性厭氧細菌、厭氧細菌發酵培養基，光生物反應器內包括微藻藻種和自養SE培養基。種子液培養合格后，分別經過各自的接種管線轉移到培養兼性厭氧細菌的內置膜分離裝置和培養微藻細胞的封閉式光生物反應器中，并加入經過無菌處理的混合培養基營養成分和酸堿中和劑調節至半混合培養所需生長條件。其中混合培養基中的有機碳源用于兼性厭氧細菌生長，而兼性厭氧細菌生長所產生的CO2用于微藻生長。兼性厭氧細菌種子液與微藻種子液接種體積比例為1:1~1:10。接種后封閉式半混合培養體系通過正常pH控制、溫度控制和通氣量等控制培養過程。其中半混合培養時有機碳源最優選采用流加方式進行，其被兼性厭氧細菌利用生長，兼性厭氧細菌發酵后產生較多的二氧化碳，排出細胞外進入培養系統中。由于兼性厭氧細菌排出的CO2處于溶解狀態，因此可以立即通過膜孔隙傳遞到光生物反應器內被混合培養基系統中的微藻細胞利用，作為微藻細胞生長的碳源供應。
[0017]下面通過附圖進一步說明本發明的詳細工藝過程。如圖1所示，兼性厭氧細菌種子I經兼性厭氧細菌種子液培養反應器3培養生長達生物量OD值為5.0~15.0 ;微藻種子2經微藻種子液培養反應器4培養生長達生物量OD值為2.0~10.0。將培養好的厭氧細菌種子液由接種管線5、微藻種子液由接種管線6分別轉接到內置膜分離裝置7和光生物反應器8中進行半混合培養，并將混合培養基及酸堿中和劑9加入膜分離裝置和光生物反應器中進行混合，同時經過檢測分析混合后培養系統中PH值來調節混合培養液的pH至6.5~
7.5。氣體由進氣口 11進入反應體系內，利用三通分別通入膜分離裝置7和導流筒10內側，從而實現向膜分離裝置內兼性厭氧細菌和光生物反應器內供氣需要，通入的氣體統一由尾氣出口 12排出整個反應體系，控制排氣閥開度，使反應器內部壓力為0.01~0.05MPa。
[0018]本發明方法中，兼性厭氧細菌在有機碳源條件下實現快速生長，兼性厭氧細菌消耗有機碳源，生成細胞生物質和各種代謝產物，細胞生物質由于體形較大而被膜截留在膜分離裝置內部，同時發酵產生CO2氣體排出細胞外后經過膜孔隙傳遞到整個混合培養基系統中，使培養體系內無機碳源含量增加，微藻細胞利用這些無機碳源進行光合作用，獲得微藻細胞自身的生長。同時兼性厭氧細菌發酵使系統的PH值下降，而隨著微藻細胞的生長，利用溶解的CO2，使系統的pH值上升，兩者互為作用，調節系統的pH處于適應范圍。[0019]本發明方法中，光生物反應器可以是板式、管式、氣升攪拌式等封閉式反應器，可以通入的氮氣或含二氧化碳氣體和導流筒作用形成返混狀態。光生物反應器的其它操作條件按常規的細菌和微藻培養條件控制。可以設置培養體系二氧化碳和溶解氧量的測定裝置，根據需要調整通氣量，以獲得良好的效果。同時提供PH電極檢測，以便通過外源加入酸、堿來實現系統PH的控制。
[0020]本發明方法中，pH控制酸中和劑為HCl、H2SO4, HNO3等常用的無機酸，堿中和劑為NaOH, NaHC03> K0H、Ca (OH) 2、氨水等常用的無機堿。
[0021 ] 本發明方法中，半混合培養過程溫度控制為內部盤管加熱方式。 [0022]本發明方法中，半混合培養中，向膜分離裝置和光生物反應器內可以通入氮氣或含二氧化碳的氣體。通氣管線進入光生物反應器后以三通形式存在，其中一條支路通入膜分離裝置中，出口引出整個反應器；其余兩支氣路分別通入兩側的導流筒內側區域，實現通氣導流作用，使膜分離裝置之外的光生物反應器內反應液可以進行混合均勻。通入氣體量隨培養液體積變化而變化，通入氣體體積速率與培養系統裝液體積比例為0.1vvm~
1.0vvm (單位液體體積每分鐘通入的單位氣體量)。
[0023]本發明方法中，光生物反應器內的培養基為兼性厭氧細菌和微藻細胞所需的混合培養基，可以提供兼性厭氧細菌的發酵生長所需營養物質，也提供微藻細胞光合生長所需營養成份，兩種細胞通過膜分離裝置被分隔開來，實現單獨生長，減弱不同細胞間生態影響，同時也為微藻細胞的收獲提供了方便。兼性厭氧細菌利用其適宜的培養基，其中碳源為有機碳源，進行生長，獲得生物量的增長，部分有機碳源通過發酵過程呼吸生成CO2,兼性厭氧細菌所生成的CO2在培養體系中作為微藻進行光合作用的碳源，從而獲得微藻細胞的生長。
[0024]本發明方法中，兼性厭氧細菌所需的有機碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液等，該有機碳源的加入采用流加補充方式進行，根據培養液樣品成份分析，隨時檢測系統的有機碳源濃度水平，將配制好的有機碳源母液按消耗速度進行流加。
[0025]本發明方法中，半混合培養過程培養基的初始有機碳源濃度(以有機物質量濃度計，下同)為1.0%~5.0%，培養過程中通過厭氧細菌生長消耗，有機碳源經過補加泵進行不斷補加，維持有機碳源濃度為1.0%~2.0%。
[0026]本發明方法中，兼性厭氧細菌種子液的培養基采用其適用的兼性厭氧細菌培養基，自養微藻種子液的培養基采用微藻SE培養基。半混合培養過程采用兼性厭氧細菌培養基和微藻培養基相結合，包括有機碳源、無機鹽和微量兀素等成份，成為混合培養基。優選的培養條件為:種子液接種量(占光生物反應器體積，V/V):5%~20% ;溫度:25°C~30°C ；通氣量:0.1vvm ~1.0vvm,攬拌轉速:IOOrpm ~400rpm,時間:24h ~120h。
[0027]方案I (比較例)
將克雷伯氏菌(中國微生物菌種保藏中心CGMCC N0.0798)在300mL搖瓶中進行培養，所用培養基為兼性厭氧細菌甘油培養基，培養20h后得到所需種子液，OD值為12.0左右。將培養的兼性厭氧細菌種子液接入含混合培養基的20L封閉式光生物反應器中內置的IOL陶瓷膜分離裝置內，膜孔直徑為0.1y m。光生物反應器為氣升攪拌式，可以實現培養液的返混；反應器為玻璃體，反應器內有溫度控制盤管，以及pH、O2和CO2傳感器。
[0028]兼性厭氧細菌為克雷伯氏肺炎桿菌，其培養基為甘油培養基。[0029]甘油培養基配方(以每升計):NH4C15.35g, KCl 0.75g，NaH2PO4 1.38g, Na2SO40.28g，MgCl2 ? 6H20 0.26g，CaCl2 ? H2O 0.02g，酵母提取物 1.0g，甘油 40g。
[0030]SE培養基配方(以每升計):
【權利要求】
1.一種封閉式培養微藻的方法，包括如下內容: (1)培養兼性厭氧細菌種子液； (2)培養自養微藻種子液； (3)將兼性厭氧細菌種子液和自養微藻種子液分別接入具有內置膜分離裝置的封閉式光生物反應器內進行半混合培養，厭氧細菌在膜分離裝置內部發酵，微藻細胞在膜分離裝置以外的光生物反應器內進行光合作用生長，兩個反應器內培養基組成和培養條件一致，培養過程中補充兼性厭氧細菌生長代謝所需的有機碳源。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的光生物反應器還包括導流筒，膜分離裝置內置于光生物反應器導流筒內，出口與光生物反應器出口平齊。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于:膜分離裝置采用陶瓷膜分離裝置，膜孔直徑為 0.05 u m ~ 0.5 u nio
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌包括芽孢桿菌、梭形桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌或克雷伯氏菌，有機碳源為葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纖維素水解液。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌種子液培養采用攪拌式生物反應器，自養微藻種子液培養采用氣升式光生物反應器。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:自養微藻包括小球藻、葡萄藻、小環藻或娃藻。
7.按照權利要求1、4或6所述的方法，其特征在于:半混合培養過程中，兼性厭氧細菌種子液與微藻種子液的初始接入體積比為1:1~1:10。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培養的初始培養基采用兼性厭氧細菌所需的培養基，同時添加微藻細胞生長所需的無機鹽和微量元素。
9.按照權利要求1、4或8所述的方法，其特征在于:半混合培養過程以批次或連續方式補充兼性厭氧細菌發酵過程所需有機碳源。
10.按照權利要求9所述的方法，其特征在于:厭氧細菌培養基初始有機碳源濃度以有機物質量濃度計為1.0%~5.0%，半混合培養過程維持有機碳源濃度以有機物質量濃度計為 1.0% ~2.0%。
11.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培養的條件為溫度20°C~37°C，pH值6~9。
12.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌種子液培養至生物量OD值為5.0~15.0，微藻種子液培養至生物量OD值為2.0~10.0。
【文檔編號】C12N1/12GK103773692SQ201210404150
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優先權日:2012年10月23日
【發明者】王領民, 金平, 廖莎, 吳丹, 李曉姝, 師文靜, 張霖, 高大成, 喬凱, 程國香 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院