一種反硝化菌的保藏方法
【專利摘要】本發明涉及一種反硝化菌的保藏方法，包括如下步驟：（1）將反硝化菌培養至生長穩定期，并收集菌體；（2）配制反硝化菌保藏營養液；（3）步驟（1）收集的反硝化菌體與步驟（2）配制的保藏營養液混合，含水率為40%～80%，含水率指反硝化菌保藏體系中水的重量含量；（4）低溫冷凍保藏。與現有技術相比本發明方法適宜于大量反硝化菌的保藏，具有方法簡單、存活率高、活性恢復快速、安全可靠等優點。
【專利說明】一種反硝化菌的保藏方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種菌體保藏方法，具體涉及一種簡單有效的低溫冷凍保藏反硝化菌的方法。
【背景技術】
[0002]氨氮是國家實現水污染控制總量控制的污染物，水體中氨氮含量過高會引起水質富營養化，導致水體中某些藻類過度繁殖，其它生物生長受到影響，從而破壞了水生生態系統，導致水質惡化并影響到其使用功能。生物脫氮技術以其環保高效無二次污染等優點是目前國內外脫氮技術研究應用的熱點。生物脫氮是在好氧條件下通過硝化反應先將氨氮氧化為硝氮或亞硝氮，再通過缺氧條件下的反硝化反應將硝氮或亞硝氮還原成氣態氮從水中除去。由此可見，反硝化過程才是真正脫氮的步驟，而完成反硝化的高性能反硝化菌被選育出來后，如何能夠長期有效的保藏至關重要。
[0003]微生物菌種是重要的生物資源之一，一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低菌體性能，能長期應用于生產中。菌種保藏的基本原理主要是根據其生理生化特征，人工創造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態，即采取低溫、干燥、缺氧等條件，使菌種暫時處于休眠狀態。一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經濟，以便在生產上能推廣使用。為了有效地保藏微生物菌種，就需要針對菌種的特性研究選用適宜的保藏方法。菌種保藏方法很多，目前國內外常用的有定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、超低溫冰箱冷凍法、超低溫液氮冷凍法等。其中定期移植法、液體石蠟法、沙土管 法、真空冷凍干燥法不適合大量菌種的保藏；超低溫液氮冷凍法和超低溫冰箱冷凍法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等，目的是防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。冷凍保存是解決種質退化和防止自然積累性突變的一種有效途徑，但傳統的低溫保存需要昂貴的程序降溫儀器，步驟繁瑣。完全玻璃化是低溫保存的一種新方法，即在高濃度保護劑下，細胞連同保護劑于快速降溫中都進入玻璃化狀態，避免胞內冰晶形成，使器官和組織各部分都進入相同的狀態，具有設備簡單、程序簡單和凍存效果好等優點。但是保護劑僅能保證菌體的存活率，對菌體活性是否有影響及影響的程度還不明確。
[0004]CN200810124325.5提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養的方法:將菌種接種于無菌的半固體培養基中，倒入無菌液體石臘后豎直存放入6~8°C的環境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。采用此方法可延長菌種的保存時間，同時菌種的濃度保持相對穩定，為生產、試驗節約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對環境的危害。但是工序復雜繁瑣，不適合大量菌體的保藏。
[0005]CN201010299763.2提供了一種冷凍保存紅細胞的方法，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N~乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，還原劑終濃度各為
0.5~300mM ;甘油的量以終體積比計為5%~10% ;乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1~IOmM ;充分混勻并調節酸度值至6.5~8.0，將容器封口，靜置I小時后在_40°C以下冷凍保存。以該方法冷凍保存的紅細胞，一年后解凍，紅細胞破碎率大于95%，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。此種方法適合細胞保藏法，不適合菌種活性的保藏。
[0006]CN200810190852.6涉及一種菌種保藏方法，包括:(I)將需要保藏的菌種接種到滅過菌的麩皮培養基中；培養基配方為50~60%麩皮、35~45%粉碎后的谷殼、I~2%硝酸鈉、I~2%尿素、I~2%米粉、0.2~1%生物素營養添加劑，加入上述混合物相同重量的去離子水，混合均勻即可；(2)當菌絲長到需要的菌齡時，不需分離出菌絲制成菌懸液，直接將凍干液立即加入安瓿管中與培養物混合均勻；凍干液配方為10~20克脫脂牛奶、0.2~
0.5克瓊脂粉、0.2~0.5克還原型谷胱甘肽、0.1~0.5克阿拉伯膠、0.5~I克叔丁醇，用去離子水定容到100毫升；(3)然后以2V /分鐘的降溫速率降溫，冷凍干燥；(4)凍干后對盛菌的安瓿管抽真空，然后封口 ；以及(5)將所得到的管置入低溫下保藏。該法采用真空冷凍干燥法保藏菌體，需要采用緩慢的降溫程序將菌體凍干進而低溫保藏，步驟繁瑣，能耗較聞。
[0007]CN200610032334.2公開一種浸礦微生物嗜酸氧化亞鐵硫桿菌深低溫冷凍保藏過程中的保護劑。其配方組成為100G/L~150G/L甘油、80G/L~120G/L海藻糖、160G/L~200G/L蔗糖、40G/L~60G/L 二甲亞砜。該保護劑可以使冷凍嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的存活率最高達到89%，但該法需添加組合的保護劑，復雜的保護劑組成對菌體的活性的影響尚無法確定。

【發明內容】

`[0008]針對現有技術的不足，本發明提供一種反硝化菌的保藏方法，適宜于大量長期保存反硝化菌。本發明方法具有方法簡單、存活率高、活性恢復快速、安全可靠等優點。
[0009]本發明反硝化菌的保藏方法，包括如下步驟:
(1)將反硝化菌培養至生長穩定期，并收集菌體；
(2)配制反硝化菌保藏營養液；
(3)步驟(1)收集的反硝化菌體與步驟(2)配制的保藏營養液混合，含水率為40%~80%，含水率指反硝化菌保藏體系中水的重量含量；
(4)低溫冷凍保藏。
[0010]本發明步驟(1)的反硝化菌培養采用本領域常規的方法，如采用間歇式活性污泥法等。反硝化菌培養液可以采用人工配制的培養液，也可以采用廢水對反硝化菌進行培養。反硝化菌培養液所含氮源為亞硝氮，亞硝氮濃度為200~800mg/L ;所含碳源為甘油，濃度以COD計為2000~5000mg/L ;還有少量Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以及磷酸根離子等。反硝化菌培養條件為:溫度15~40°C,pH為7.0~8.5,攪拌轉速10~50rpm,缺氧條件下培養3~10天至生長穩定期。反硝化菌培養至生長穩定期，此時是指菌體適宜保藏的生長期，通過沉降、過濾、離心等方法收集獲得的反硝化菌體。反硝化菌培養的初始來源可以是任意的需要保藏的反硝化菌。[0011]本發明步驟(2)中，保藏營養液中含有的亞硝氮為NaNO2，同時含有微量物質FeSO4, KH2PO4, MgCl2和CaCl2。各種物質的用量按步驟(3)中所需的濃度確定。
[0012]本發明步驟(3)中，反硝化菌與保藏營養液混合后，甘油濃度以COD計為2~5g/L, NO2-~N 濃度為 0.2 ~0.8g/L, Fe2+ 濃度為 0.01 ~0.06g/L, K.濃度為 0.05 ~0.5g/L,Ca2+ 濃度為 0.01 ~0.lg/L, Mg2+ 濃度為 0.05 ~0.5g/L。
[0013]本發明步驟(4)中，低溫冷凍保藏可以采用本領域常規的超低溫冷凍設備。冷凍保藏溫度為-20°C~-70°C。
[0014]本發明方法通過從菌體培養、含水率、營養液等方面進行綜合優化考察，得到了最適宜的反硝化菌低溫冷凍保藏方法。反硝化菌的培養碳源為甘油，甘油同時可以作為低溫冷凍保藏的保護劑，不需要專門添加保護劑，反硝化菌對甘油具有適應性，不會影響菌體的活性。本發明方法可以延長菌種的保存時間，同時使菌種的活性保持相對穩定，菌體保藏后存活率高，活性恢復迅速，對于大量菌體保藏經濟方便，為生產、試驗節約成本。本發明方法簡單，不需特殊設備，方便快捷，適合大量菌種保藏，存活率可以達到90%以上。
【具體實施方式】
[0015]本發明的一種具體實施過程如下:
Cl)利用適宜的培養液，在溫度15~40°C，pH為7.0~8.5，攪拌轉速10_50rpm，缺氧條件下將反硝化菌培養3~10天至生長穩定期，然后收集菌體。
[0016](2)菌懸液的含水率對于胞內外冰晶的形成有影響，進而影響保藏效果，因此需要適宜的含水率。菌體培養液的初始含水量較高，因此需要降低菌體含水率。
[0017](3)營養物質是菌體生存的必備條件，可使菌體在低溫冰箱中保藏若干年，而不影響其活性，需要按照適宜的營養物質組成和濃度加入保藏所需的營養液。
[0018](4)低溫冰箱凍存:低溫冷凍溫度是在_20°C至_70°C，保藏3~5年能力后，考察菌體的存活率和活性。
[0019]實施例1
配制亞硝氮濃度為200mg/L，甘油為碳源，濃度以COD計為2500mg/L的培養液，在IOL生物反應池中采用間歇式活性污泥法對反硝化菌進行培養，溫度為27°C，pH為7.8，攪拌轉速20rpm。當菌體進入穩定生產期后停止培養，沉降或離心后收集菌體。按照50%的含水率，將菌體與配制的營養液混合，于_50°C低溫冰箱保藏。2年后取出考察菌體的活性和存活率，經過3d的恢復，菌體的活性可以完全恢復，存活率可達95%。
[0020]反硝化菌與保藏營養液混合物中，營養物質的組成和濃度為:甘油濃度以COD計為 2.5g/L，NO2-~N 濃度為 0.2g/L，Fe2+ 濃度為 0.02g/L, K.濃度為 0.lg/L, Ca2+ 濃度為
0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0.lg/L。
[0021]實施例2
配制亞硝氮濃度為600mg/L，甘油為碳源，濃度以COD計為4000mg/L的培養液，在IOL生物反應池中采用間歇式活性污泥法對反硝化菌進行培養，溫度為30°C，pH為8.0，攪拌轉速40rpm。當菌體進入穩定生長期后停止培養，沉降或離心后收集菌體。按照60%的含水率，將菌體與配制的營養液混合，于_60°C低溫冰箱保藏。4年后取出考察菌體的活性和存活率，經過5d的恢復，菌體的活性可 完全恢復，存活率可達90%。[0022]反硝化菌與保藏營養液混合物中，營養物質的組成和濃度為:甘油濃度以COD計為 4g/L,N<V ~N 濃度為 0.6g/L,Fe2+濃度為 0.02g/L,K+濃度為 0.lg/L,Ca2+濃度為 0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0.lg/Lo
[0023]實施例3
配制亞硝氮濃度為400mg/L,甘油為碳源,濃度以COD計為3000mg/L的培養液中，在IOL生物反應池中采用間歇式活性污泥法對反硝化菌進行培養，溫度為32°C，pH為8.0，攪拌轉速30rpm。當菌體進入穩定生長期后停止培養,沉降或離心后收集菌體。按照70%的含水率，將菌體與營養液混合，于_70°C低溫冰箱保藏。5年后取出考察菌體的活性和存活率，經過7d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達92%。
[0024]反硝化菌與保藏營養液混合物中，營養物質的組成和濃度為:甘油濃度以COD計為 3g/L，NO2-~N 濃度為 0.4g/L，Fe2+ 濃度為 0.02g/L, K+ 濃度為 0.lg/L，Ca2+ 濃度為 0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0 .lg/Lo
【權利要求】
1.一種反硝化菌的保藏方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將反硝化菌培養至生長穩定期，并收集菌體； (2)配制反硝化菌保藏營養液； (3)步驟(1)收集的反硝化菌體與步驟(2)配制的保藏營養液混合，含水率為40%~80%，含水率指反硝化菌保藏體系中水的重量含量； (4)低溫冷凍保藏。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)的反硝化菌培養采用間歇式活性污泥法。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)的反硝化菌培養液所含氮源為亞硝氮，亞硝氮濃度為200~800mg/L。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)的反硝化菌培養液所含碳源為甘油，濃度以COD計為2000~5000mg/L。
5.根據權利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:反硝化菌的培養溫度為15~40°C, pH為7.0~8.5,攪拌轉速10~50rpm,缺氧條件下培養3~10天至生長穩定期。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)的反硝化菌培養至生長穩定期后，通過沉降、過濾或離心方法收集獲得反硝化菌體。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)的保藏營養液中含有的亞硝氮為NaNO2,同時含有微量物質 FeSO4、KH2PO4、MgCl2 和 CaCl2。
8.根據權利要求1所述 的方法，其特征在于:步驟(3)的反硝化菌與保藏營養液混合后，甘油濃度以COD計為2~5g/L，NO2--N濃度為0.2~0.8g/L，Fe2+濃度為0.01~0.06g/L, K+ 濃度為 0.05 ~0.5g/L, Ca2+ 濃度為 0.01 ~0.1g/I, Mg2+ 濃度為 0.05 ~0.5g/L。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，低溫冷凍保藏溫度為-20°C~-70°C。
【文檔編號】C12N1/04GK103773684SQ201210404038
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優先權日:2012年10月23日
【發明者】孫丹鳳, 高會杰, 張鵬, 李寶忠 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院