專利名稱：一種沙眼衣原體重組蛋白質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域，特別是涉及一種沙眼衣原體重組蛋白質及其制備方法。
背景技術：
沙眼衣原體是I種細胞內寄生菌，它的感染形態是原體。原體感染宿主細胞，轉變為代謝活躍的網狀體，經二分裂增殖，最終仍產生原體，從細胞中釋放出來感染新的細胞。沙眼衣原體所引起的泌尿生殖道感染是性傳播疾病(sextransmitted disease, STD)中最常見的I種，在性活躍期感染率高。沙眼衣原體的傳播受多種因素的影響，其中年齡、性別、種族、避孕措施、多性伴、既往沙眼衣原體感染史、性伴有性傳播疾病表現、合并其他疾病等因素均可成為獨立危險因素。據世界衛生組織估計，全球每年新發的性傳播沙眼衣原體感染患者約8900萬。近年來，由沙眼衣原體感染而導致的非淋菌性尿道炎、陰道炎、宮頸炎、子宮內膜炎等已超過淋球菌感染而居性傳播疾病之首，從而引起不孕不育。 沙眼衣原體的患病人群以青壯年為主。感染后，潛伏期為數天到數月，一般是I 3周。感染沙眼衣原體后婦女最常見的是引起化膿性宮頸炎，出現膿性白帶增多，可伴有外陰瘙癢。如果引起尿道炎時，約一半病人出現尿急、尿頻和排尿困難，與淋病性尿道炎不同的是，沙眼衣原體引起的尿道炎無尿痛癥狀，或尿痛很輕微，可有少量的尿道分泌物。如果巴氏腺被感染，還能弓I起巴氏腺炎。一般而言，女性患者多數癥狀很輕，或者沒有自覺癥狀，因此常被忽略，容易造成本病的傳播。多數衣原體引起的疾病可根據臨床癥狀和體征確診。但對早期或經癥患者，須行實驗室檢查來幫助診斷。目前實驗室檢查衣原體的方法有衣原體細胞培養法、血清學方法和核酸擴增法。其中以衣原體細胞培養法最敏感、最可靠，但由于操作繁瑣、費用高、培養時間長且受標本采集、運送、保存及實驗技術的影響，一般實驗室難以開展。核酸擴增法由于應用特異性引物，大大增強了檢測的敏感性和特異性，但對實驗室條件、儀器設備、人員專業素質要求很高，且容易因為核酸擴增產物的交叉污染而出現假陽性。血清學檢查簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用。本發明提供了一種用基因工程方法生產的重組抗原，利用該重組抗原進行檢測能夠避免由于蛋白質抗原純度低或特異性差造成假陽性而降低檢測特異性等問題，為沙眼衣原體感染的檢測提供了一種更為特異、準確的檢測用原料和檢測方法。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供一種沙眼衣原體重組蛋白和試劑盒，本發明的另一目的是提供該沙眼衣原體重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。(二)本發明的技術方案本發明提供了一種編碼沙眼衣原體蛋白的重組核酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發明還提供了一種沙眼衣原體蛋白的的表達載體pET-28a-Ctl43，它是將SEQID NO: I所示所述的核苷酸序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒，其制備流程圖譜如附圖2所示。將表達載體pET-28a-Ctl43導入大腸桿菌中，得到表達蛋白的工程菌株。本發明利用SEQ ID NO: I所示核苷酸序列通過基因工程方法制備Ct蛋白可以通過如下步驟實現I)獲得具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；2)將該核苷酸序列導入質粒，優選pET_28a質粒；3)將該質粒導入原核宿主細胞，優選大腸桿菌宿主細胞，更優選BL21 (DE3)菌株中； 4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養所述宿主細胞；5)回收、純化及復性所表達的重組蛋白。本發明還涉及包含本發明沙眼衣原體蛋白的組合物以及試劑盒。所述的組合物可作為檢測沙眼衣原體感染的試劑。本發明的沙眼衣原體蛋白可用于制備檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其中所述試劑盒中沙眼衣原體蛋白抗原可以是膠體金標記的包被在硝酸纖維素膜上的抗原，膠體金復合物噴點量為60. O μ 1/cm2，硝酸纖維素膜上還包被有抗人IgM抗體和兔抗沙眼衣原體抗體，抗人IgM的抗體劃線包被量為I. 0μ 1/cm，濃度為I. Omg/ml，兔抗沙眼衣原體抗體包被量為I. O μ 1/cm,包被濃度為5. Omg/ml。(三)有益效果采用本發明提供的沙眼衣原體蛋白制備的檢測試劑盒，與市場上的同類試劑盒相t匕，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了 CT感染臨床診斷的需要。


圖IPCR擴增產物的凝膠電泳圖；圖2是表達質粒pET-28a_Ctl43的構建流程圖；圖3是誘導后菌體12% SDS — PAGE電泳圖，其中M表示Marker，I表示目的蛋白。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。實施例I沙眼衣原體重組蛋白的制備I. I沙眼衣原體蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆從GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)獲取 D 標準株 Ctl43基因全長序列(GenBank:NC 000117. I),以此DNA序列為模板，設計一對特異性引物，并在上下游分別加入NdeI和XhoI酶切位點及保護性堿基，所設計的特異性引物序列如下F1 ATCGCATATG ATGAAGAAACCAGTATTTACAGGGGG 41. 67%Tm=64. 64R1 GATCCTCGAGTTAATCTGCCTCCTTATAAGAAG 42. 42%Tm=63. 49以沙眼衣原體D標準株D/UW. 3/CX (購自中國藥品生物制品檢定所)基因組為模板，以引物Fl和Rl進行PCR擴增，擴增得到Ctl43片段；50 μ I PCR 擴增體系為ddH20 31. 5 μ I, IOXbuffer 5·0μ 1,4XdNTP 4. O μ I,上、下游引物混液 4. O μ I, DNA I. 5 μ 1，Taqplus O. 2 μ I (IU)；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，按DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京 TAKARA 公司，產品名稱TAKARA MiniBEST Plasmid purification)說明從含 DNA 條帶的膠塊回收DNA;擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如附圖I所示；質粒pET_28a (具有Xho I和Nde I酶切位點，購自華美生物公司)和Ctl43均經內切酶酶切，50μl體系10xbuffer5·0μl，DNA12μl，Xho I 和 Nde I 各 15U，ddH20補至50 μ I ;37°C水浴6h。50 μ I酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，切割DNA條帶瓊脂塊，并按DNA快速純化試劑盒說明回收經過酶切的pET-28a和Ct 143。將Ctl43酶切基因片段連接至pET_28a質粒，20μ1連接體系ddH2015. O μ 1，IOxbuffer 2. O μ 1，PET_28a 2. 0μ I, Ctl43 I. 0 μ 1，T4DNA 連接酶 20U ;質粒自身連接對照，20 μ I連接反應體系ddH20 16. O μ I, IOx buffer 2. O μ 1，PET_28a
2.O μ I, T4DNA連接酶20U ;按上述加樣后，混勻、稍離心，14°C _16°C連接過夜；轉化E. coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養基)并挑選克隆提取質粒測序，確定序列正確的克隆。重組質粒的酶切(Ndel/Xhol)流程圖如附圖2所示。I. 2產物測序測序引物為F1和Rl及T7promoter和T7terminator的通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成以及重組質粒序列pET-28a-Ctl43的測定都由華大基因公司提供服務。測得目的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。I. 3沙眼衣原體重組融合蛋白的表達、純化將驗證正確克隆的質粒(pET-28a_Ctl43)，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自華美生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含體內進行表達將含有Ctl43基因的BL21 (DE3)宿主菌培養到OD O. 6，用終濃度ImM IPTG誘導表達，4小時之后收集菌體、超聲破碎、高速離心、收集沉淀。對收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrose fast flow)進行純化，用如下溶液洗脫300mM咪唑，20mM Tris, 500MmNaCl, 8M Urea。Ctl43融合基因表達蛋白共281個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。I. 4沙眼衣原體重組融合蛋白鑒定I. 4. I純度和分子量的測定經SDS — PAGE電泳檢測(蛋白上樣量10 μ g)，為單一區帶，薄層掃描鑒定純度為95. 8%。分子量約為31Kd，檢測結果見附圖3。I. 4. 2濃度測定經Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標準參比品，抗原蛋白濃度為 3. 5±0· 12mg/mL。1.4.3活性測定用間接ELISA方法測定。包被量2. O μ g/孔，使用內部質控血清測定OD值，結果見表I。表I沙眼衣原體重組融合蛋白活性測定結果
權利要求
1.一種編碼沙眼衣原體蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一種沙眼衣原體蛋白，其特征在于它由權利要求I所述的重組DNA序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.一種可表達沙眼衣原體蛋白的表達載體pET-28a-Ctl43，其特征在于它是將權利要求I所述的重組DNA序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒。
4.一種表達沙眼衣原體蛋白的工程菌株，其特征在于它是含有權利要求3所述的表達 載體pET-28a-Ctl43的大腸桿菌。
5.一種檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于其組分中用于檢測沙眼衣原體的抗原是根據權利要求2所述的重組蛋白。
6.權利要求2所述的一種檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于其中的抗原是膠體金標記的抗原。
7.權利要求6所述的一種檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于膠體金標記的抗原包被在硝酸纖維素膜上，膠體金復合物噴點量為60. O μ 1/cm2。
8.權利要求7所述的一種檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于硝酸纖維素膜上還包被有抗人IgM抗體和兔抗沙眼衣原體抗體。
9.權利要求8所述的一種檢測沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于抗人IgM的抗體劃線包被量為I. O μ 1/cm,濃度為I. Omg/ml,兔抗沙眼衣原體抗體包被量為I. O μ 1/cm,包被濃度為5. Omg/ml ο
10.根據權利要求2所述的沙眼衣原體蛋白、權利要求3所述的表達載體pET-28a-Ctl43或權利要求4所述的工程菌株在制備用于檢測沙眼衣原體的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明提供一種沙眼衣原體重組蛋白質及其制備方法，涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域。本發明涉及一種可用于沙眼衣原體感染臨床診斷的沙眼衣原體融合蛋白，編碼該蛋白的核苷酸序列，包括該核苷酸序列的質粒和原核宿主細胞，本發明還包括制備該蛋白的方法的及其應用。該重組蛋白質具有高特異性、強免疫原性，可提高檢測試劑的敏感性和特異性，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，很好地滿足了人沙眼衣原體感染臨床診斷的需要。
文檔編號C12R1/01GK102925462SQ201210421450
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者華艷, 陳廷友, 張曉剛 申請人:英諾特(唐山)生物技術有限公司