專利名稱：Scx/hic雙功能混合模式色譜固定相及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于蛋白質(zhì)分離的高效液相色譜固定相，具體地說是一種疏水/ 強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相，本發(fā)明還涉及該混合模式固定相的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)的發(fā)展，無論重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)還是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究都依賴于蛋白質(zhì)的高效快速的分離技術(shù)。復(fù)雜樣品的分析對(duì)分離科學(xué)提出了越來越高的要求，而發(fā)展新型高效分離材料、分離模式和高靈敏度的檢測(cè)方法是解決該問題的有效途徑之一。多維液相色譜(MDLC)是蛋白質(zhì)組學(xué)等復(fù)雜樣品分離分析的關(guān)鍵技術(shù)。通常的一根色譜柱只能利用一種分離模式對(duì)生物大分子進(jìn)行分離純化，如反相(RPLC)、疏水(HIC)、 離子交換(IEC)和親合(AFC)等。所以目前二維液相色譜ODLC)的構(gòu)建就需要兩根作用力性質(zhì)完全不同的色譜柱。“混合模式色譜”(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白質(zhì)與固定相配基之間多種相互作用力進(jìn)行分離的[姚善涇等，化工學(xué)報(bào)，2007，58: 2169-2177 ；Zhao G F, et al. ,J Biotech, 2009，144 :3-11; Mc Laughlin, et al., Chem Rev, 1989，89 :309-319]。混合保留機(jī)理的分離介質(zhì)可提供兩種以上的作用力用于溶質(zhì)的分離。與單一色譜分離模式相比，MMC具有更高的選擇性和吸附量。一些學(xué)者采用溴化氰法把脂肪胺和芳香胺交聯(lián)在瓊脂糖上，合成疏水相互作用固定相。由于配體上帶有胺基，使這種疏水固定相具有一定的離子交換性質(zhì)，因此認(rèn)為蛋白質(zhì)的分離是靜電相互作用和疏水相互作用的共同結(jié)果。1986年，Regnier小組首次合成了陰離子交換/疏水色譜混合模式的陰離子交換固定相[Kennedy L A, et al, J Chromatogr A, 1986，359: 73-84]； 隨后Horvath小組報(bào)道了同樣的結(jié)果[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989，469: 3-27]。雖然現(xiàn)在MMC有反相和離子交換混合模式[Apfelthaler E, et al, J Chromatogr. A, 2008，1191: 171-181]、反相和親水混合模式[Liu X，et al. J Chromatogr. A, 2008，1191: 83-89]、親水和離子交換混合模式[Strege M A, et al., Anal Chem, 2000， 72: 4629-4633]等類型，但MMC仍以一種作用力為主，另一種力為輔，所以混合保留機(jī)理的色譜填料都是以一種分離模式為主的，即一種分離模式的分離較好，而另一種分離差，不能有效地用于蛋白質(zhì)樣品的二維分離，因此不能稱之為二維色譜填料。雖然混合模式色譜柱已商品化，如GE公司的Capto MMC和Capto adhere, Pall公司的ΗΕΑ,ΡΡΑ和MEP色譜柱等，均是以離子交換為主，疏水作用為輔。所以，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種混合色譜填料可以分別用兩種完全不同的功能(如IEC和HIC)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二維液相分離，而且都能得到以某種單一分離模式進(jìn)行分離時(shí)達(dá)到的分離效果。2009年發(fā)明人研究小組合成出了一種同時(shí)具有疏水和弱陽離子交換雙功能基團(tuán)的新型高效色譜分離介質(zhì)[柯從玉等,科學(xué)通報(bào),2008，53 614 616 ；Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009, 1216: 3553-3562]。在高鹽濃度下表現(xiàn)為疏水色譜的性質(zhì)，可作為疏水色譜分離介質(zhì)使用；而在低鹽濃度條件下表現(xiàn)為離子交換色譜的性質(zhì)，可作為離子交換色譜分離介質(zhì)使用，并深入研究了在疏水和離子交換兩種模式下蛋白質(zhì)的混合保留機(jī)理[Liu P, et al., J Chromatogr. A, 2009, 1216: 7497 - 7504]。與相應(yīng)的單機(jī)理色譜填料相比，表現(xiàn)出獨(dú)特的選擇性，在一定程度上提高了分離能力。在此基礎(chǔ)上，利用閥切換技術(shù)，采用一根具有 WCX-HIC的二維色譜柱構(gòu)建了在線二維液相色譜分離系統(tǒng)，稱之為單柱-二維液相色譜分離新技術(shù)[Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009，1216: 3553—3562]。文獻(xiàn)報(bào)道的2DLC中，多在第二維采用RPLC。但由于強(qiáng)的疏水性和有機(jī)環(huán)境，大多數(shù)蛋白質(zhì)會(huì)失去活性甚至變性。而HIC和IEC分離條件溫和，能更好地保持生物大分子的天然結(jié)構(gòu)和生物活性，IEC配合HIC最適合蛋白質(zhì)的分離純化[Ascenjo J A, et al. , J Mol Recog., 2004, 17: 236-247]。上述的IEC-HIC單柱二維色譜，最大程度地保證了整體蛋白的生物活性，實(shí)現(xiàn)了活性整體蛋白的快速分離純化。目前單柱二維色譜新技術(shù)剛剛起步，該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)主要依賴于雙功能色譜填料的開發(fā)與制備。但是專門為分離蛋白質(zhì)而設(shè)計(jì)的雙功能色譜填料還很少，種類很有限。與常規(guī)的二維色譜不同的是，利用這種IEC/HIC雙功能分離介質(zhì)，可以在一根色譜柱上完成 HIC-IEC或IEC-HIC 二維色譜。該單柱二維色譜柱的優(yōu)異功能表現(xiàn)在，可實(shí)現(xiàn)用一根該色譜柱代替兩根常用的離子交換和疏水色譜柱的快速分離蛋白的新方法，這將大大降低生物大分子分離純化所需要的分離介質(zhì)的數(shù)量，從而大大降低生物大分子，特別是重組蛋白藥物的生產(chǎn)成本，對(duì)生物大分子的分離純化具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型疏水/強(qiáng)陽離子交換混合模式色譜固定相，以滿足分別在離子交換模式和疏水模式下實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的高效分離要求。本發(fā)明的另一目的在于提供上述色譜固定相的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為
結(jié)構(gòu)式(I)所示的疏水/強(qiáng)陽離子交換(HIC/SAC)混合模式色譜固定相，
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式(I)所示的疏水/強(qiáng)陽離子交換混合模式色譜固定相，
2.權(quán)利要求1所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，包括以下步驟(1)胱氨酸與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)后加入硅膠反應(yīng)得胱氨酸鍵合硅膠衍生物；(2)將胱氨酸鍵合硅膠衍生物與DDT反應(yīng)得半胱氨酸鍵合硅膠衍生物；(3)將半胱氨酸鍵合硅膠衍生物與濃硫酸反應(yīng)得到磺酸基鍵合硅膠衍生物；(4)將磺酸基鍵合硅膠衍生物與脂肪族醇、芳香族醇或PEG，以及DIC、DMAP反應(yīng)得疏水 /強(qiáng)陽離子交換混合模式色譜固定相。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)取1份重量的胱氨酸溶于堿性緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH至11.0，冰浴攪拌下，加入 0. 5 1份重量的硅烷偶聯(lián)劑，冰浴攪拌反應(yīng)30 min,然后升溫至60 80°C反應(yīng)12 M小時(shí)，反應(yīng)完畢，用冰醋酸調(diào)反應(yīng)液pH至4. O 7. 0，加入0. 5 1份重量的硅膠，80 95°C 下反應(yīng)1. 5 4小時(shí)，過濾、洗滌、干燥，即可得到胱氨酸鍵合硅膠衍生物；(2)將1份重量的胱氨酸鍵合硅膠衍生物分散于pH為7 8的緩沖溶液中，加入0.1 0. 4份重量的DDT，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 3小時(shí)，過濾、洗滌、干燥即可得到半胱氨酸鍵合硅膠衍生物；(3)將半胱氨酸鍵合硅膠衍生物分散于甲醇和25 35%的H2A的混合溶液中，攪拌下滴入濃硫酸，使反應(yīng)液呈弱酸性，在20 35°C下反應(yīng)10 M小時(shí)，產(chǎn)物過濾、洗滌、干燥即可得到磺酸基鍵合硅膠衍生物；(4)將1份重量的磺酸基鍵合硅膠衍生物分散于有機(jī)溶劑中，加入1.5 3份重量的脂肪族醇、芳香族醇或PEG，1. 5 3份重量的DIC，0. 1 0. 3份重量的DMAP，室溫?cái)嚢鐼 48小時(shí)，產(chǎn)物過濾、洗滌、干燥即可得疏水/強(qiáng)陽離子交換混合模式色譜固定相。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(1)所述堿性緩沖溶液為0. 5mol/L的Na2CO3緩沖溶液，每克胱氨酸所需緩沖溶液的量為50 70mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(1)所述硅烷偶聯(lián)劑結(jié)構(gòu)如下
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(1)中所用的硅膠為全多孔硅膠小球，粒徑為3 40Mm，孔徑為50 300 ， 且經(jīng)過1 1鹽酸活化3 7小時(shí)，然后洗至中性，100 160°C真空干燥10 M小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(2)中所用緩沖溶液為lmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，每克胱氨酸鍵合硅膠衍生物所需緩沖溶液的量為10 20mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(3)中的氧化反應(yīng)以甲醇與25 35%的H2A體積比1:2 5的混合溶液再加入濃硫酸使之呈弱酸性為反應(yīng)介質(zhì)，每克半胱氨酸鍵合硅膠衍生物所需反應(yīng)液體積為 30 40mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相制備方法，其特征在于步驟(4)中所用有機(jī)溶劑為二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺，每克磺酸基鍵合硅膠衍生物所需有機(jī)溶劑的量為25 40mL。
10.權(quán)利要求1所述的疏水/強(qiáng)陽離子交換雙功能混合模式色譜固定相在蛋白分離純化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)構(gòu)通式(I)所示的用于蛋白質(zhì)分離的強(qiáng)陽離子交換/疏水混合模式色譜固定相，其中X為-OCH3或-OCH2CH3；R為，其中n=1~5；或，其中n=1~6；或PEG200-1000。本發(fā)明將胱氨酸通過硅烷偶聯(lián)劑鍵合到表面帶有羥基的活化硅膠表面上，再用DTT將硅膠表面的胱氨酸二硫鍵打開形成巰基化硅膠，然后再用H2O2將巰基氧化為磺酸基形成磺酸基鍵合硅膠衍生物，最后再與脂肪族醇(或芳香族醇或PEG等)反應(yīng)而獲得疏水/強(qiáng)陽離子交換色譜固定相。該固定相可以分別在疏水模式和強(qiáng)陽離子交換模式下實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的有效地分離，用一根裝填這種雙功能分離介質(zhì)的色譜柱可代替兩根常用的強(qiáng)陽離子交換和疏水色譜柱對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。
文檔編號(hào)B01J20/286GK102527357SQ201210004100
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者白泉, 趙開樓 申請(qǐng)人:西北大學(xué)