專利名稱：郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因和探針，具體是一種郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因和探針。
背景技術：
花的顏色是影響植物傳粉的重要因素，同時也決定一種花卉的商品價值和觀賞價值。改變花色，創造新花色，可以增加花卉的商品價值和觀賞價值。花朵顏色是花瓣細胞中積累花色素的結果。類黃酮是花色素的一大類，它使花朵產生從黃到紫的全部顏色。在類黃酮的合成途徑中，黃烷酮-3-羥化酶(F3H)是緊接查爾酮合成酶(CHS)，查爾酮異構酶(CHI)的第三個酶。它催化黃烷酮在C3位置羥基化形成無色的黃烷酮醇，也能夠催化圣草酚、柚皮素、5羥基雙氫黃酮等在3'位置的羥基化，生成二氫黃酮醇。由于二氫黃酮醇是黃酮醇和花色素的共同前體，因此，F3H是位于類黃酮合成通路分支點處的關鍵酶。
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F3H在決定種皮和花的顏色中具有重要作用。擬南芥中F3H的突變會導致種皮中色素的減少，葉和莖等器官中的的花色素減少，從而使種皮顏色變為灰白色。抑制F3H基因的表達也可以直接阻礙類黃酮的合成。用反義RNA技術阻止F3H基因在一種同時缺乏二氫黃酮醇3'-羥化酶(F3, H)和二氫黃酮醇3'，5'-羥化酶(F3, 5' H)的康乃馨突變株中的表達時，得到了一系列顏色由原本橘色逐漸衰減至無色的轉基因植株；矮牽牛花中通過反義抑制F3H的表達，使花顏色由原來的橙色/微紅色減弱甚至完全失去。目前，很多植物中的F3H基因已被分離鑒定，如大麥、蘋果、紫花苜蓿、玉米、擬南芥等，但對于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana),F3H基因的克隆、表達模式及F3H蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香F3H蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報道。

發明內容
本發明的目的在于填補郁金香F3H基因家族成員的克隆、表達模式分析以及郁金香F3H蛋白及其編碼基因序列的空白，提供了一種郁金香Tf F3H蛋白，本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針。本發明提供了郁金香TfF3H蛋白及其編碼基因序列在郁金香不同器官、不同發育階段的表達模式，為今后利用基因工程技術對TfF3H基因的時空表達特性進行調控，從而改變花色，創新花色提供了理論依據，具有重大的應用價值。本發明是通過以下技術方案實現的，—方面，本發明提供了具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。該蛋白質在花朵的不同發育階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經過I 50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個以內氨基酸而得到的序列。進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。另一方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。優選的，所述核酸序列具體為(a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第I 1101位所示；或(b)與SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸進行雜交的序列。
優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的序列。此外，本發明提供了一種用于檢測上述核酸序列的探針，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼郁金香F3H相關的核酸分子。在本發明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。在本發明中，術語“TfF3H蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香TfF3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所不序列的第I 1101位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 3所示序列中第I 1101位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ IDN0. 4所示的氨基酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 3所示序列中從核苷酸第I 1101位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的郁金香TfF3H相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。在本發明中，術語“ TfF3H蛋白”指具有郁金香TfF3H蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的蛋白質。該術語還包括具有與天然郁金香TfF3H相關相同功能的、SEQ ID NO. 4所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括郁金香TfF3H蛋白的活性片段和活性衍生物。本發明的郁金香TfF3H多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與郁金香TfF3H相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfF3H多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發明中，“郁金香TfF3H保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行替換而產生。表I
權利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(a)由如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID NO. 4所示氨基酸序列經過I 50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20 個以內氨基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為Ca)堿基序列如SEQ ID NO. 3第I 1101位所示；或(b)與SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID NO. 3第I 1101位所示的核酸序列中I 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在Y和/或:V 端添加60個以內核苷酸形成的序列。
7.一種用于檢測如權利要求4所述核酸序列的探針，其特征在于，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個連續核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及一種郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質為如下(a)或(b)的蛋白質(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列，以及檢測上述核酸序列的探針；本發明為利用基因工程技術對郁金香TfF3H基因的時空表達特性進行調控，從而改變花色、創新花色提供了理論依據，具有重大的應用價值。
文檔編號C12N15/11GK102994463SQ20121042845
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學