郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因，所述蛋白質(zhì)為由如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。黃烷酮-3-羥化酶是類黃酮合成通路重要的分支點催化酶，是整個黃酮類化合物代謝途徑的中樞。將本發(fā)明中郁金香黃烷酮-3-羥化酶基因通過構(gòu)建反義表達載體轉(zhuǎn)化到橙紅色矮牽牛后，50%以上轉(zhuǎn)基因矮牽牛花色變淺，對應(yīng)的花朵總花色苷含量下降了30%-50%。利用本發(fā)明提供的郁金香黃烷酮-3-羥化酶基因TfF3H，能為利用基因工程改變花色，獲得創(chuàng)新花色提供一種有效的技術(shù)手段。
【專利說明】郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關(guān)鍵酶及其編碼基因，具體是一種郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H蛋白及其編碼基因，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]類黃酮(Flavonoids)包括花色素苷和其它黃酮類色素，是植物中一大類次生代謝產(chǎn)物，使植物的花、葉、果、莖產(chǎn)生豐富的色彩，對昆蟲傳粉、生長素運輸、保護葉片免受紫外線傷害、抑制病蟲害和根瘤誘導(dǎo)方面有重要作用。類黃酮的合成途徑中，黃烷酮-3-羥化酶(F3H)是緊接黃烷酮-3-羥化酶(CHS)，查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的第三個酶。研究顯示F3H是重要的分支點催化酶，可能是整個黃酮類化合物代謝途徑的中樞。它催化黃烷酮在C3位置羥基化形成無色的黃烷酮醇，也能夠催化圣草酚、柚皮素、5羥基雙氫黃酮等在3’位置的羥基化，生成二氫黃酮醇，為黃酮醇、兒茶精、花色素、原花色素等黃酮類化合物代謝支路提供前體物。
[0003]F3H在決定種皮和花的顏色中具有重要作用。擬南芥中F3H的突變會導(dǎo)致種皮中色素的減少，葉、莖等器官中的的花色素減少。抑制F3H基因的表達也可以直接阻礙類黃酮的合成，如用反義RNA技術(shù)阻止F3H基因在一種同時缺乏二氫黃酮醇3’-羥化酶(F3’H)和二氫黃酮醇3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)的康乃馨突變株中的表達時，得到了一系列顏色由原本橘色逐漸衰減至無色的轉(zhuǎn)基因植株；在黃酮類化合物代謝途徑中抑制F3H表達可以促進黃酮和異黃酮產(chǎn)物的合成，如利用基因敲除可沉默大豆中F3H基因的功能，能夠?qū)⒃龃蟮拇x流量分流到異黃酮合成途徑中，進而增加大豆種皮中的異黃酮含量。
[0004]目前，很多植物中的F3H基因已被分離鑒定，如大麥、蘋果、紫花苜蓿、玉米、擬南芥等，但對于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana),F3H基因的克隆、表達模式及F3H蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香F3H蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻報道。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H的蛋白序列，還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明提供了郁金香黃烷酮-3-羥化酶蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達模式，構(gòu)建了 TfF3H基因的反義表達載體并轉(zhuǎn)化矮牽牛，分析了 TfF3H基因?qū)D(zhuǎn)基因矮牽牛花色及花朵中花色苷含量的影響。利用本發(fā)明提供的郁金香黃烷酮-3-羥化酶TfF3H，能為基因工程改變花色，獲得創(chuàng)新花色提供一種有效的技術(shù)手段。
[0006]本發(fā)明提供了具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在花朵的不同發(fā)育階段、不同器官內(nèi)的有無及活性大小存在較大差異。[0007]優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列經(jīng)過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0008]進一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0009]另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0010]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為:
[0011](a)堿基序列如SEQ ID N0.3第I~1101位所示；
[0012]或(b)與SEQ ID N0.3第I~1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0013]或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1101位所示的核酸進行雜交的序列。
[0014]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第I~1101位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。
[0015]此外，本發(fā)明提供了一種用于檢測上述核酸序列的探針，所述探針為包含有所述核酸序列8~100個連續(xù)核苷酸的核酸分子。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼郁金香F3H相關(guān)的核酸分子。
[0016]在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中相伴隨的 蛋白質(zhì)分開。
[0017]在本發(fā)明中，術(shù)語“TfF3H蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香TfF3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID N0.3所不序列的第I~1101位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0.3所示序列中第I~1101位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID N0.3所示序列中從核苷酸第I~1101位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0018]該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的郁金香TfF3H相同功能的蛋白的SEQ ID N0.3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
[0019]在本發(fā)明中，術(shù)語“ TfF3H蛋白”指具有郁金香TfF3H蛋白活性的SEQ ID N0.4所示序列的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括具有與天然郁金香TfF3H相關(guān)相同功能的、SEQ ID N0.4所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括郁金香TfF3H蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0020]本發(fā)明的郁金香TfF3H多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴謹條件下能與郁金香TfF3H相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfF3H多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0021]在本發(fā)明中，“郁金香TfF3H保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
[0022]表1
【權(quán)利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由如SEQID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香黃烷酮-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.4所示氨基酸序列經(jīng)過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID N0.4所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為: Ca)堿基序列如SEQ ID N0.3第I~1101位所示； 或(b)與SEQ ID N0.3第I~1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1101位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID N0.3第I~1101位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。
【文檔編號】C12N15/53GK103614348SQ201310529319
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月31日
【發(fā)明者】袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學(xué)