一種熒光素標記核苷酸的制備方法
【專利摘要】本發明公開了本一種熒光素標記核苷酸的制備方法，具體涉及一種熒光素羅丹明B標記脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的制備方法，過程包括溶液A配制、溶液B配制、偶合、層析；偶合包含反應開始、反應終止、緩沖穩定和濃度調節。將丙烯胺-dUTP原溶液與NaHCO3緩沖溶液加入溶液A配制罐(1)中，制得溶液A；將與丙烯胺-dUTP相同摩爾量的羅丹明B(Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO(二甲基二砜)中制得溶液B；使溶液A與溶液B在室溫下進入偶合分別進入反應開始階段(3)、反應終止階段(4)、緩沖穩定階段(5)、調節濃度階段(6)；最后將偶合反應物加入層析柱(7)，收集純化的Rhodamine-dUTP，最終獲得的產物。
【專利說明】一種熒光素標記核苷酸的制備方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種熒光素標記核苷酸的制備方法，具體涉及一種熒光素羅丹明B標記脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的制備方法，而這種熒光素標記的DNA探針可廣泛用于DNA熒光原位雜交臨床檢驗,也可用于細胞凋亡熒光檢測試劑盒。
【背景技術】:
[0002]人類基因組計劃的完成促進了以核酸為基礎的臨床診斷、法醫DNA鑒定、檢驗檢疫技術的發展。因此核酸的定性與定量分析變得越來越重要。熒光素標記檢測技術的誕生，極大促進了核酸測量技術的發展，該技術正逐漸取代傳統同位素標記技術，在核酸測量中廣泛應用。熒光素標記核苷酸作為熒光技術中的重要工具，已應用于醫學、農業、環境和生物學等領域。隨著應用領域的拓展，對熒光素標記核苷酸的質量控制、純度和量值準確提出了更高的要求。
[0003]熒光素標記核苷酸Rhodamine-dUTP作為一種靈敏度高、量值準確的核酸探針標記原料，是生產熒光原位雜交臨床檢驗試劑盒、細胞凋亡熒光檢測試劑盒過程中的一種關鍵性中間產品。

【發明內容】
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[0004]本發明的目的是針對上述情況，提供一種熒光素標記核苷酸Rhodamine-dUTP的制備方法，其制備的Rhodamine-dUTP能夠提高檢測的特異性、可靠性、均一性和靈敏度。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的熒光素標記核苷酸Rhodamine-dUTP制備方法，主要包括以下的步驟:
[0006](I)將丙烯胺-dUTP (脫氧尿嘧啶核苷三磷酸)原溶液加入到NaHCO3緩沖溶液中制得溶液A。
[0007](2)將Rhodamine (羅丹明B)溶解于DMSO (二甲基二砜)制得溶液B。
[0008](3)使溶液A與與溶液B在室溫下經過2.5-4.5小時的偶合反應作用之后，按以下順序進行每一個反應:a加入甘氨酸使反應停止；b加入緩沖液用于穩定核苷酸；c加入水，使得dUTP溶液的終濃度為0.5-1.5mmol/L。
[0009](4)將反應混合物加入層析柱，去除 未標記的羅丹明B和dUTP，收集純化的羅丹明-dUTP。
[0010]從而制的所需的突光素標記核苷酸Rhodamine-dUTP。
[0011]本發明提供的技術方案的有益效果是:通過本方法可以獲得標記率(純度)較高的dUTP 99.9%，在-20°c下穩定一年以上，在-80°c下穩定三年以上。同時，由于熒光素羅丹明B較為廉價，使得該反應具有較高的經濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0012]圖1是熒光素羅丹明B標記脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的制備方法發明示意圖，其中，1、溶液A配制罐2、溶液B配制罐3、偶合反應開始階段4、偶合反應終止階段5、偶合緩沖穩定階段6、偶合液濃度調節階段7、層析柱
【具體實施方式】
[0013]如圖1所示，本發明的過程包括溶液A配制、溶液B配制、偶合、層析；偶合包含反應開始、反應終止、緩沖穩定和濃度調節。
[0014]將10-30mmol/L(毫摩爾)的丙烯胺-dUTP 原溶液、0.1-0.3mmol/L 的 NaHCO3 緩沖溶液加入溶液A配制罐(I)中，制得溶液A;將與丙烯胺-dUTP相同摩爾量的羅丹明B (Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO (二甲基二砜)中制得溶液B。
[0015]使溶液A與溶液B在室溫下進入偶合反應開始階段(3)，進行偶合反應2.5-4.5小時；之后加入0.1-0.3n 2mol/L的甘氨酸(pH pH 7.0-9.0，溶液終濃度為10-30mmol/L)使偶合反應終止階段(4);反應終止后，加入0.3-0.5n lmol/L Tris-HCl緩沖液(三羥甲基氨基甲烷與鹽酸混合而得)，pH7.0-9.0(溶液終濃度為10-30mmol/L)，是偶合反應液進入緩沖穩定階段(5);再加入10-30n的水，進行偶合混合液的調節濃度階段(6)，使得dUTP溶液的終濃度為0.5-1.5mmol/L。
[0016]最后將偶合反應混合物加入層析柱(7)，去除未標記的羅丹明和dUTP，收集純化的Rhodamine-dUTP，最終獲得的產物。、
【權利要求】
1.一種熒光素標記核甘酸的制備方法，具體涉及一種羅得明標記脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(Rhodamine-dUTP)的制備方法，主要包括以下步驟:溶液A配制、溶液B配制、偶合、層析；偶合包含反應開始、反應終止、緩沖穩定和濃度調節。
2.根據權利要求1所述一種熒光素標記核甘酸的制備方法，其特征在于，將10-30mmol/L(毫摩爾)的丙烯胺-dUTP原溶液、0.1-0.3mmol/L的NaHCO3緩沖溶液加入溶液A配制罐(I)中，制得溶液A ;將與丙烯胺-dUTP相同摩爾量的羅丹明B(Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO (二甲基二砜)中制得溶液B。
3.根據權利要求1所述一種熒光素標記核甘酸的制備方法，其特征在于，使溶液A與溶液B在室溫下進入偶合反應開始階段(3)，進行偶合反應2.5-4.5小時；之后加入0.l-ο.3n 2mol/L的甘氨酸(pH 7.0-9.0，溶液終濃度為10-30mmol/L)使偶合反應終止階段(4);反應終止后，加入0.3-0.5n lmol/LTris-HCl緩沖液(三羥甲基氨基甲烷與鹽酸混合而得)，PH7.0-9.0 (溶液終濃度為10-30mmol/L)，是偶合反應液進入緩沖穩定階段(5);再加入10-30n的水，進行偶合混合液的調節濃度階段(6)，使得dUTP溶液的終濃度為0.5-1.5mmol/L。
4.根據權利要求1所述一種熒光素標記核甘酸的制備方法，其特征在于，將偶合反應混合物加入層析柱(7 )，去除未標記的羅丹明B和dUTP，收集純化的Rhodamine-dUTP。
【文檔編號】C12N15/10GK103468671SQ201210441732
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年11月8日 優先權日:2012年11月8日
【發明者】繆為民, 陸宏卿, 舒麗, 景曉輝 申請人:江蘇美中醫療科技有限公司