專利名稱：磁-聲復合作用的離體細胞標記裝置和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，具體而言，涉及一種磁-聲復合作用將磁性氧化鐵納米微粒裝載到離體細胞內的方法和裝置。
背景技術：
將氧化鐵磁性納米微粒載入細胞使細胞成為具有磁性的細胞，在細胞治療、分子成像等領域有廣泛應用，但氧化鐵磁性納米粒子在自然狀態(tài)并不能有效地被細胞攝取而進入細胞。為促進細胞對磁性微粒的攝取，采用了多種方法，包括生物方法、物理方法和化學方法。生物轉染劑介導法 以轉染劑(如病毒、脂質體、高分子聚合物等)作為載體，將磁性粒子以某種方式與特異性受體、抗體或基因結合，通過細胞表面相應的受體使磁性粒子與細胞結合，使細胞具有磁性而成為磁性細胞化學方法通過對磁性粒子表面功能化修飾，使不具有吞噬能力或吞噬能力較弱的細胞，利用粒子表面的電荷特性、表面效應等特性促使磁性納米粒子與細胞膜表面相互作用或細胞通過吞噬、吞飲等方式將磁納米粒子內吞于細胞體內。物理方法主要是通過對細胞膜施一外加的能量，提高細胞膜對外源物質的攝取。這類方法包括電穿孔法、顯微注射法、聲致穿孔效應等。顯微注射法直接將待傳輸物質注入細胞，效率很高；電穿孔法利用電脈沖作用使細胞膜穿孔，磁性微粒通過這些微孔進入細胞。聲致穿孔法是應用超聲波引起的振動使細胞膜產生非特異性空隙，使細胞膜通透性增加。上述生物轉染劑介導方法中，以病毒為載體的方法效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達，但存在潛在的安全危險性。脂質體轉染劑介導法，因脂質體本身會參與細胞生理活動，也可能造成細胞毒性。目前眾多的研究者將新一代轉染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質體的聚合物上，以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術正成為人們研究的方向。但目前應用的陽離子聚合物轉染試劑，仍然存在轉染效率不高和細胞毒性的問題。另外，轉染劑有特異性且磁性微粒需與細胞經數小時甚至幾天的共同孵育才能達到理想的標記效果。在這長時間的孵育過程中，轉染劑潛在一些變化可能破壞細胞膜的結構和功能，還可能破壞蛋白和DNA。采用對磁性微粒進行表面功能化修飾的化學方法，由于不同結構類型的表面處理劑對納米鐵氧體的作用機理存在很大的差異，因此應根據細胞類型對磁性微粒進行不同的表面修飾。物理方法中，顯微注射法雖然轉染率較高，但需要昂貴的儀器，并且細胞操作時，需要一個細胞一個細胞地注射，不適合大量細胞研究的需要。電穿孔法因使用高壓電脈沖作用于細胞，對細胞的損傷較大。超聲方法超聲提高細胞膜通透性存在閾值劑量，不易控制，且現有設備每次實驗時只能對一個樣本進行操作，效率很低。總之，物理方法不存在特異性問題和細胞毒性，且方法簡單安全，但與轉染劑方法相比傳輸效率較低。

發(fā)明內容
針對以上所描述的現有技術存在的各種問題，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種安全、快速進行離體細胞磁性標記的裝置，同時提供一種通過磁場引導磁性微粒運動、非接觸控制磁性液體對流及空化微泡的運動，加強超聲空化效應，使磁性納米微粒快速進入離體細胞的物理方法，設備簡單，易于操作，并具有較高的標記效率。本發(fā)明的目的是通過下述技術方案予以實現本發(fā)明一方面涉及磁-聲復合作用的細胞標記裝置，其包括超聲發(fā)射裝置、位于超聲范圍內盛放去離子除氣水的液體空化槽,液體空化槽中設有細胞樣品管以及位于液體·空化槽兩邊的磁場產生裝置。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的超聲發(fā)射部分包括聚焦超聲換能器、信號發(fā)生器、超聲功率放大器和阻抗匹配網絡。核心部分為聚焦超聲換能器，所用壓電晶片直徑5cm，中心頻率1. 25MHz，用有機玻璃做球面聚焦聲透鏡，焦距5cm。信號發(fā)生器產生的信號經超聲功率放大器、匹配網絡后驅動所述超聲換能器，當超聲換能器發(fā)射頻率為1. 25MHz時，電聲轉換效率31. 7%。超聲功率放大器在0-10W范圍線性放大；考慮到換能器本身的電容特性，使用換能器數據設計、加工相應阻抗匹配網絡，使負載阻抗與源阻抗匹配，以實現最大的功率傳輸，最大輸出電阻50 Ω。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的磁場產生裝置為亥姆霍茲線圈。亥姆霍茲線圈用于產生交變磁場。亥姆霍茲線圈與一可變電阻串聯，最后接入50Hz交流穩(wěn)壓電源，磁場輻照裝置接通電源時，能生成場強為0-500高斯連續(xù)可調的磁場。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的液體空化槽中還設有溫度傳感裝置，樣品管,標尺等。所述液體空化槽為圓筒式結構,直徑12cm，高度15cm，筒壁材質為有機玻璃，壁厚O. 6cm，并用硅酮或聚硫玻璃膠緊密粘接在一起，不透水。優(yōu)選的，液體空化槽與所述超聲換能器同軸超聲換能器驅動槽內液體發(fā)生空化效應；進一步優(yōu)選的，磁場輻照裝置由亥姆霍茲線圈產生，換能器液體槽置于兩線圈之間，正中放置；樣品管采用一次性醫(yī)用薄壁吹塑試管，壁厚不大于O. 2mm,其聲阻抗可忽略。用于盛放待標記的細胞與磁性微粒膠體溶液的混懸液，所述薄壁試管和溫敏元件均要浸在所述空化液體槽內的液體中；溫敏元件用以監(jiān)測空化液體的溫度變化。關于亥姆霍茲線圈的結構說明亥姆霍茲線圈由一對直徑150mm, 300阻密繞的同軸載流圓線圈組成，兩線圈相距75mm。兩線圈中通一同向電流,輸入電源為220V,50Hz穩(wěn)壓電源。通過調節(jié)可變電阻調節(jié)線圈中電流大小，進而改變線圈間磁場強度，線圈間磁場0-500高斯連續(xù)可調，由高斯計標定線圈間磁場磁場。如圖2所示，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，磁-聲復合作用的細胞標記裝置包括超聲換能器2. 9，筒式液體空化槽2-5，阻抗匹配網絡2-6，信號發(fā)生器2-8，超聲功率放大器2-7及亥姆霍茲線圈2-14。其中，超聲換能器2-9置于圓筒形有機玻璃空化槽2-5底部，兩者共軸并用硅酮或聚硫玻璃膠緊密粘接在一起，構成不透水的超聲空化槽，見圖1，所述超聲換能器2-9與阻抗匹配網絡2-6連接，所述阻抗匹配網絡2-6使超聲換能器2-9達到最大輸出功率。阻抗匹配網絡2-6與超聲功率放大器2-7連接，所述超聲功率放大器2-7選用高頻線性功率放大器并與信號發(fā)生器連接2-8。所述信號發(fā)生器2-8產生的信號經超聲功率放大器2-7放大，阻抗匹配網絡2-6調節(jié)，使超聲換能器2-9達到最大輸出功率，進而使筒式液體空化槽2-5內液體空化。亥姆霍茲線圈2-14與可變電阻2-13串聯，所述可變電阻2-13與交流穩(wěn)壓電源2-12連接，所述兩個亥姆霍茲線圈2-14兩間的磁場用高斯計監(jiān)測，所述交流穩(wěn)壓電源輸出電流0-10A。標記時，筒式液體空化槽2-5固定支座2-10上并置于兩線圈2-14之間，槽2-5內盛放4°C去離子 除氣水，超聲換能器2-9被驅動后空化槽內液體水發(fā)生空化效應。樣品管2-1浸在槽內液體中，筒式液體空化槽2-5的液面高于樣品管2-1液面。當槽內液體發(fā)生空化時，樣品管2-1內細胞、磁性微粒混懸液2-3將處于超聲換能器2-9所產生的聲場的焦點區(qū)域，同時處于亥姆霍茲線圈2-14通電后所產生的橫向均勻磁場區(qū)域；空化放熱引起的液體溫度變化由針式溫度傳感器2-4監(jiān)測，溫度變化控制在O. 5°C范圍。本發(fā)明另一方面還涉及使用上述裝置將磁性氧化鐵納米微粒裝載到離體細胞中內方法，其包括如下步驟向超聲換能器液體空化槽內注入4°C的去離子除氣水，軟木塞密封。將樣品管固定在裝滿除氣水的換能器水槽中，并調整樣品管的位置，使樣品管中心軸與換能器中心聲軸線一致；將細胞懸浮液轉移進入樣品試管中，用移液槍加入一定量的氧化鐵磁性納米微粒膠體溶液并吹勻，并使氧化鐵微粒在細胞懸浮液中的終濃度在25-1000 μ g/ml。試管用封口膜密封，并使混懸液中心高度位于換能器焦區(qū)中心，同時也處于磁場區(qū)域；先打開磁場產生裝置，然后啟動超聲發(fā)生裝置，調節(jié)超聲功率放大器，使輸出電功率在2-8W范圍，對細胞進行標記O. 5-5分鐘；樣品處理完后，先關閉超聲發(fā)生裝置；20_40秒后關閉磁場發(fā)生裝置拿下樣品管，離心收集細胞，用磷酸緩沖液清洗細胞表面多余的氧化鐵納米微粒，即得到標記好的磁性細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的磁性氧化鐵納米微粒為葡聚糖包覆，微粒尺寸在50-500nm之間。采用本發(fā)明的裝置和方法進行離體細胞標記，能極大的提高納米磁性微粒對細胞標記效果。


圖1 :帶有圓筒式液體槽的聚焦超聲器結構示意圖；其中11壓電陶瓷晶片12背襯材料13聲聚焦透鏡14電極引線21換能器的金屬保護外殼31有機玻璃圓筒
圖2 :磁場引導下的離體細胞磁標記裝置結構示意圖其中2-1樣品管2-2軟木塞2-3細胞懸浮液2-4針式溫度傳感器2-5筒式液體空化槽2-6阻抗匹配網絡2-7超聲功率放大器 2-8信號發(fā)生器2-9超聲換能器2-10換能器支座2-11 標尺2-12交流穩(wěn)壓電源2-13可變電阻2-14亥姆霍茲線圈
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。下面結合附圖和實施例，詳細說明使用本發(fā)明的裝置對離體細胞進行標記的步驟和效果。實施例1I)本實施方式中所用超聲換能器諧振頻率1.25MHz，待標記細胞為小鼠Sarcoma 180腹水瘤細胞；2)亥姆霍茲線圈間磁場標定將線圈2-14與可變電阻2-13和交流穩(wěn)壓電源2-12串聯，打開電源，改變電阻，用高斯計對線圈正中位置的磁場強度進行校準，當磁場強度為300高斯時，停止電阻2-13的調節(jié)，關閉電源2-12。3)使用圖2所示裝置，向空化槽2-5內注入適量4°除氣去離子水，并將空化槽2-5置于兩個亥姆霍茲線圈2-14間軸線的正中位置。4)向樣品管2-1內轉移IOml濃度為2X 106cells/ml的Sarcomal80細胞懸浮液2-3，同時加入Iml濃度400 μ g/ml葡聚糖包覆氧化鐵磁性納米膠樣水溶液(自制)并吹勻，封口膜密封，浸入空化槽2-5。調整細胞溶液2-3的中心位于換能器2-9焦點處。5)打開交流穩(wěn)壓電源2-12，給亥姆霍茲線圈2-14通電。6) 30秒后，啟動信號發(fā)生器2-8，調整功率放大器輸出電功率為2W，輻照待標記細胞 lmin。7)樣品處理完后，關閉超聲功率放大器2-7 ;30秒后，關閉磁化線圈2_14，拿下樣品管2-1，離心收集細胞，用磷酸緩沖液清洗細胞表面多余的氧化鐵，細胞標記完成。實施例2
本實施例中，調整所加入的葡聚糖包覆氧化鐵磁性納米膠樣水溶液的濃度，向細胞懸浮液中加入Iml濃度為50 μ g/ml的氧化鐵磁性膠樣水溶液，其他步驟同實施例1。實施例3本實施例中，調整所加入的葡聚糖包覆氧化鐵磁性納米膠樣水溶液的濃度，向細胞懸浮液中加入Iml濃度為800 μ g/ml的氧化鐵磁性膠樣水溶液，其他步驟同實施例1。實施例4本實施例中，調整磁化電流使線圈間磁場為500高斯，其他步驟同實施例1。實施例5
本實施例中，調整磁化電流使線圈間磁場為100高斯，其他步驟同實施例1。為了驗證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人將本發(fā)明實施例1，2，3，4，5的標記效果與沒有磁場干預、其他條件相同情況下(對照組)小鼠SarcomalSO標記率進行了對照，見表I。(對照組均無磁場參與，僅有超聲作用；標記后細胞活性用臺盼藍染色法進行檢驗)。表1. Sarcomal80細胞磁聲復合標記率與對照組實驗結果比較
權利要求
1.磁-聲復合作用的細胞標記裝置，其包括超聲發(fā)射裝置，位于超聲范圍內盛放去離子除氣水的液體空化槽，液體空化槽中設有細胞樣品管以及位于液體空化槽兩邊的磁場產生裝置。
2.根據權利要求1所述的細胞標記裝置，所述的超聲發(fā)射部分包括超聲換能器、信號發(fā)生器、超聲功率放大器和阻抗匹配網絡。
3.根據權利要求1或2所述的細胞標記裝置，所述的磁場產生裝置為亥姆霍茲線圈。
4.根據權利要求1或2所述的細胞標記裝置，所述的液體空化槽中還設有溫度傳感裝置，樣品管，標尺；優(yōu)選的，液體空化槽與所述超聲換能器同軸超聲換能器驅動槽內液體發(fā)生空化效應；進一步優(yōu)選的，磁場輻照裝置由亥姆霍茲線圈產生，換能器液體槽置于兩線圈之間，正中放置。
5.使用權利要求1-4任意一項所述的細胞標記裝置將磁性氧化鐵納米微粒裝載到離體細胞中的方法，其包括如下步驟向超聲換能器液體空化槽內注入去離子除氣水，軟木塞密封；將樣品管固定在裝滿除氣水的換能器水槽中，并調整樣品管的位置，使樣品管中心軸與換能器中心聲軸線一致；將細胞懸浮液轉移進入樣品試管中，用移液槍加入濃度為50-1500 μ g/ml的磁性氧化鐵納米微粒膠體溶液并吹勻，用封口膜密封樣品管，并使混懸液中心高度位于換能器焦區(qū)中心，同時也處于均勻磁場區(qū)域；先打開磁場產生裝置，然后啟動超聲發(fā)生裝置，調節(jié)超聲功率放大器，使輸出電功率在 2-8W范圍，對細胞進行標記O. 5-5分鐘；樣品處理完后，先關閉超聲發(fā)生裝置；20-40秒后關閉磁場發(fā)生裝置；拿下樣品管，離心收集細胞，用磷酸緩沖液清洗細胞表面多余的氧化鐵納米微粒，即得到標記好的磁性細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，所述的磁性氧化鐵納米微粒為葡聚糖包覆，微粒尺寸在50-500nm之間。
7.根據權利要求5所述的方法，所述氧化鐵納米微粒在細胞懸浮液中的終濃度在 25-1000 μ g/ml 之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了磁-聲復合作用的細胞標記裝置以及使用該裝置將磁性氧化鐵納米微粒裝載到離體細胞中的方法，該裝置包括超聲發(fā)射裝置、位于超聲場范圍內盛放去離子除氣水的液體空化槽，液體空化槽中設有細胞樣品管，位于液體空化槽兩邊的磁場產生裝置。采用本發(fā)明的裝置和方法進行離體細胞標記，能極大的提高納米磁性微粒對細胞標記效果。
文檔編號C12M1/42GK102994383SQ20121045154
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權日2012年11月13日
發(fā)明者莫潤陽, 林書玉, 王公正 申請人:陜西師范大學