專利名稱：山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法
技術領域：
本發明涉及一種山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法。
背景技術：
卵母細胞又稱為卵子，是一個新的生命個體發生發育的前提和基礎。隨著現代生命科學的發展，卵母細胞是家畜新品種培育、轉基因育種和品種改良等方面的重要的材料。對于人類生殖健康而言，卵母細胞的體外成熟培養是試管嬰兒誕生的基礎。因此，卵母細胞的體外培養技術是現代生殖發育的核心技術。卵母細胞在體內存在于卵巢上，出生后的動物卵巢上存在的卵母細胞停滯于生發泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且數量有限，伴隨著年齡的增長，數量不斷減少，并最終枯竭，卵母細胞的體內發生發育特點也就決定了卵子的稀有珍貴。在正常生長發育的情況下，卵母細胞外周包裹有大量的卵丘細胞，卵丘細胞在卵母細胞開始形成時就已顆粒細胞的形式存在，伴隨著卵母細胞的生長和發育，其數量逐步增多，并且在卵母細胞生長發育的過程中，分泌各種物質，同卵母細胞進行物質和信息的交換，從而調控卵母細胞的發生發育，因此，卵丘細胞在卵母細胞外圍的存在質量將直接影響卵母細胞發育的狀態和結果。維甲酸(retinoic acid, RA)是體內維生素A的代謝中間產物，主要影響骨的生長和促進上皮細胞增生、分化、角質溶解等代謝作用，在臨床實踐中常用于治療尋常痤瘡、銀屑病、魚鱗病、扁平苔癬、毛發紅糠疹、毛囊角化病、鱗狀細胞癌及黑色素瘤等疾病。凋亡是細胞對環境的生理性病理性刺激信號，環境條件的變化或緩和性損傷產生的應答有序變化的死亡過程，細胞過度凋亡會引起機體組成的組織或器官退化。在卵母細胞的體外成熟培養過程中，一定濃度的RA能夠抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，將為卵丘細胞的體外發育調控奠定基礎，也為卵母細胞的高質量生產提供平臺
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，包括以下步驟:
(I)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養
卵巢采集于屠宰場宰殺后的山羊，分離出2 8_卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養；挑取的卵丘卵母細胞復合物經操作液清洗后，置于成熟液中，培養時，將維甲酸(retinoic acid, RA)添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C培養；所述操作液組分為TCMl99 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱氨酸 + 10ng/ml EGF ；(2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測
成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物經透明質酸酶液滴中脫去卵丘細胞；收集卵丘細胞置于1.5ml離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉錄至cDNA ;經熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平；
(3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測
成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經透明質酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。作為優選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM 1000 nM。作為進一步優選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM。作為進一步優選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為100 nM。作為進一步優選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為1000 nM。本發明的有益效果是:
在山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養過程中，添加維甲酸(retinoic acid,RA)能夠有效地抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，進而促進山羊卵母細胞細胞核與細胞質的成熟。本發明為通過抑制卵丘 細胞凋亡促進山羊卵母細胞發育能力提供了新的研究途徑。
具體實施例方式一、材料與方法
(I)山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養
卵巢采集于屠宰場宰殺的山羊，利用精細鑷和手術刀片分離出2 8mm卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養；挑取的卵丘卵母細胞復合物經操作液(TCM199 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素)清洗后，置于成熟液(TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/mlL-半胱氨酸+ 10ng/ml EGF)中，培養時，將維甲酸(下簡稱RA)分次以10 nM, 100 nM和1000 nM添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C 培養。(2)山羊卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測
成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物經500 μ I lmg/ml透明質酸酶液滴中脫去卵丘；收集卵丘細胞置于1.5ml離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉錄至cDNA ;經熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平；15 μ I反應體系:0.9 μ I山羊特異性引物，7.5μ1 SYBR Green Supermix 1.5 μ I稀釋的cDNA及5.I μ I水；每個反應至少設3個生物學重復。(3)山羊卵丘細胞凋亡末端標記檢測
成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經透明質酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。(4)統計與分析
所有結果均以平均值土標準差表示；使用SPSS軟件中的t-test對數據進行統計學分析。P〈0.05表不差異顯著。二、結果
(I)RA促進山羊卵母細胞的成熟
在山羊卵母細胞成熟培養液中，添加RA能夠顯著促進卵母細胞的成熟(p〈0.05)，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培養液中卵母細胞的成熟率分別達到78.68%、76.83%和73.59%,顯著高于未添加RA的對照組65.33%。(2) RA減少山羊卵丘細胞的凋亡
經原位末端轉移酶標記檢測顯示，未經RA培養的卵丘卵母細胞復合物中，卵母細胞外周卵丘細胞呈現大量凋亡，經過RA培養后，卵母細胞外周卵丘細胞呈現凋亡現象明顯減少；通過把卵母細胞外圍卵丘細胞消化收集檢測統計后顯示，在成熟培養期間添加RA處理后，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培養液中卵丘細胞的凋亡率分別為5.98%,4.27%和5.26%,顯著低于未添加RA的對照組9.31%(ρ〈0.01)。(3 ) RA促進山羊卵丘細胞抗凋亡基因的表達
實時熒光定量PCR檢測顯示，相對于未添加RA的對照組，卵母細胞在成熟培養期間經RA處理2(T22h后，凋亡基因Caspase-8表達水平顯著下調(10 nM, p<0.05 ；100 nM,p<0.05 ；1000 nM p〈0.01)。抗凋亡基因BAX表達水平均顯著上調(10 nM, p<0.05 ；100nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.05)、抗凋亡基因CAT基因表達水平均顯著上調(10 ηΜ, ρ〈0.05 ;100 nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.01)，及抗凋亡基因BCL-2基因表達水平均顯著上調(10 nM,p〈0.01 ；100 nM, p〈0.01 ；1000 nM p〈0.05)。以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
權利要求
1.山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，包括以下步驟: (1)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養 卵巢采集于屠宰場宰殺后的山羊，分離出2 8mm卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養；挑取的卵丘卵母細胞復合物經操作液清洗后，置于成熟液中，培養時，將維甲酸添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C培養；所述操作液組分為TCM199 + 5% FBS +100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 I U/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱;氛酸 + 10ng/ml EGF ； (2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測 成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物經透明質酸酶液滴中脫去卵丘細胞；收集卵丘細胞置于1.5mI離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉錄至cDNA ;經熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平； (3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測 成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養的卵丘卵母細胞復合物經透明質酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經原位末端轉移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。
2.根據權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM 1000 nM。
3.根據權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM。
4.根據權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為100 nM。
5.根據權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為1000 nM。
全文摘要
本發明公開了山羊卵丘細胞體外培養抗凋亡處理方法，包括以下步驟(1)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養挑取的卵丘卵母細胞復合物經操作液清洗后，置于成熟液中，培養時，將維甲酸添加到成熟液中，50～80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5°C培養；所述操作液組分為TCM199+5%FBS+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+10%FBS+10IU/mlPMSG+5IU/mlhCG +0.1mg/mlL-半胱氨酸+10ng/mlEGF；(2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測(3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測。本發明在山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養過程中，添加維甲酸(RA)能夠有效地抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，進而促進山羊卵母細胞細胞核與細胞質的成熟。
文檔編號C12N5/075GK103215221SQ201310071009
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者蒲勇, 曹鴻國, 章孝榮, 王張帆, 卞雅尼, 張運海, 劉亞, 李運生, 方富貴, 陶勇 申請人:安徽農業大學