林可霉素發酵用復合蛋白粉的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種林可霉素發酵用復合蛋白粉，其由以下質量百分比的組分組成：20％～25％的冷榨黃豆粉、15％～30％的花生餅粉、10～25％的棉籽蛋白粉和20％～55％的魚粉。本發明的復合蛋白粉經200L發酵罐驗證發酵單位可達至9561μg/ml，大幅領先目前國內的平均水平，具有很好的應用價值。
【專利說明】林可霉素發酵用復合蛋白粉
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵【技術領域】，具體的說，本發明涉及一種林可霉素發酵用復合蛋白粉。
【背景技術】
[0002]自20世紀60年代發現林可霉素(Iincomycin)以來，林可霉素的發酵產率有了大幅度的提高。但是，一般企業生產過程中普遍存在發酵中后期菌絲斷裂嚴重并提前發生自溶的問題，大大影響了林可霉素的生物合成速率以及有效生物合成時間。研究表明，高濃度游離氨基氮和溶解磷能促進細胞的生長和繁殖，可以縮短菌體繁殖所需要的時間，而同時又抑制許多抗生素的生物合成，對工業生產具有重要的指導意義。中國專利申請CN101092597A公開了一種生產林可霉素用復合培養基，其發酵液林可霉素生物效價在7200單位/毫升左右。林可霉素及其衍生物依然是臨床上使用量較大的抗生素，因此，亟需解決目前林可霉素發酵生產中存在的問題提高發酵單位。

【發明內容】

[0003]本發明針對林可霉素發酵過程中菌絲提前自溶而影響產物生物合成的問題，根據林可霉素的代謝特性，采用多種動植物蛋白復配并篩選得到一種復合蛋白粉，經200L發酵罐驗證發酵單位可達至9561 μ g/ml，具有很好的應用價值。
[0004]因此，本發明目的在于提供一種林可霉素發酵用有機蛋白粉，以利于提高林可霉素的發酵水平。
[0005]本發明提供的復合蛋白粉由多種動植物蛋白復配并篩選得到，該復合氮源含有豐富的蛋白質、氨基酸、植物多糖、維生素及核酸。
`[0006]本發明的林可霉素發酵用復合蛋白粉的特征在于，其由以下質量百分比的組分組成:20 %~25 %的冷榨黃豆粉、15 %~30 %的花生餅粉、10~25 %的棉籽蛋白粉和20 %~55%的魚粉。
[0007]根據本發明一個優選的實施方式，林可霉素發酵用復合蛋白粉由以下質量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、20%~25%的花生餅粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的魚粉。
[0008]本發明中所述復合蛋白粉總氮含量為52.5% -55.5%、氨基氮含量為12.5% -14.5%、總磷含量為 1.6% -1.9%.[0009]本發明的復合蛋白粉能夠顯著減緩菌絲自溶和提高林可霉素的生物合成速率，從而提高發酵效價。經200L發酵罐驗證發酵單位可達至9561 μ g/ml，大幅領先目前國內的平均水平，具有很好的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為如實施例1所述不同種類氮源對林可霉素發酵效價的影響；[0011]圖2為如實施例4所述發酵罐中不同氮源對林可霉素發酵效價的影響；
[0012]圖3為如實施例4所述不同含量的復合蛋白粉發酵168h時的菌絲形態。
【具體實施方式】
[0013]以下結合具體的實施例，對本發明做進一步說明。以下實施例僅用于說明本發明，并非用于限定本發明的范圍。
[0014]本發明中所用的原料來源如下:冷榨黃豆粉、花生餅粉、棉籽蛋白粉、魚粉、玉米漿、泡敵、硅油等購自河南天方藥業股份有限公司；可溶性淀粉購自國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖購自上海西王淀粉糖有限公司；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。
[0015]菌種:林可鏈霉菌Streptomyces lincolnensis SIP1-A.2118,由河南省天方藥業有限公司提供。
[0016]斜面培養基(g/L):可溶性淀粉20，冷榨黃豆粉5，K2HPO40.5，NaCl0.5，KNO3I,MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.01，瓊脂 22，ρΗ7.0 ~7.5 ;121°C 滅菌 30min。
[0017]種子培養基(g/L):可溶性淀粉20，葡萄糖15，冷榨黃豆粉20，玉米漿25，(NH4)2S042, CaC034, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。滅菌 30min。
[0018]原始搖瓶發酵培養基( g/L):淀粉15，葡萄糖65，冷榨黃豆粉25，玉米漿15，(NH4)2S048, NaN038, NaCl5，KH2PO40.2，CaC038, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。滅菌 30min。
[0019]原始發酵罐培養基(g/L):淀粉10，葡萄糖50，冷榨黃豆粉15，玉米漿15，(NH4) 2S044, NaN034, NH4N034, NaCl5, KH2PO40.5，CaC038，泡敵 0.35，硅油 0.25，ρΗ6.5 ~7.5 ;121°C 滅菌 30min。
[0020]稀料培養基(g/L):玉米漿150，冷榨黃豆粉90，CaC036，泡敵1，硅油I。
[0021]培養條件:斜面、種子、搖瓶及發酵罐發酵均采用30°C培養，培養周期分別為7~10d、2d、7d和8d，搖瓶培養的培養基裝量為100ml/750ml，轉速220r/min。發酵罐中稀料采用分批補料的方式，每隔12小時補一次，補料量為發酵液總體積的2%。
[0022]HPLC檢測條件:色譜柱ODS C18，4.6mmX 250mm, 5 μ m ;檢測波長:214nm ;進樣量:10 μ L ;流速:0.8ml/min ;柱溫:35°C ；
[0023]流動相:0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調pH至6.1):甲醇=50: 50
[0024]實施例1-3:復合蛋白粉用于林可霉素發酵與原配方對比
[0025]實施例1
[0026]復合蛋白粉的質量百分比組成為:冷榨黃豆粉25%，花生餅粉30%，棉籽蛋白粉15%,魚粉30%。所述復合蛋白粉的總氮含量52.5%、氨基氮含量14.5%、總磷含量1.9%。
[0027]以原始搖瓶發酵培養基(搖瓶發酵單位3500yg/ml左右)為對照，以不同氮源(棉籽蛋白粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨、魚粉、玉米蛋白粉、酵母膏、牛肉膏和實施例1所述的復合蛋白粉)替代對照組中10g/L的冷榨黃豆粉，考察氮源對林可霉素生物合成的影響。結果見圖1，其中棉籽蛋白粉、蛋白胨和本發明實施例1的復合蛋白粉均能提高林可霉素的生物合成，尤其是使用本發明實施例1的復合蛋白粉作氮源，林可霉素的發酵效價可提高至 4500 μ g/ml。
[0028]實施例2[0029]復合蛋白粉的質量百分比組成為:冷榨黃豆粉20%，花生餅粉25%，棉籽蛋白粉10%,魚粉45%。所述復合蛋白粉的總氮含量55.5%、氨基氮含量12.5%、總磷含量1.6%。
[0030]以原始搖瓶發酵培養基為對照，用實施例2的復合蛋白粉替代原始搖瓶發酵培養基中20g/L的冷榨黃豆粉，考察對林可霉素生物合成的影響。最終林可霉素的發酵效價可提高至 4650 μ g/ml ο
[0031]實施例3
[0032]復合蛋白粉的質量百分比組成為:冷榨黃豆粉20%，花生餅粉30%，棉籽蛋白粉25 %，魚粉25 %。所述復合蛋白粉的總氮含量53 %、氨基氮含量13 %、總磷含量1.7%。
[0033]以原始搖瓶發酵培養基為對照，用實施例3的復合蛋白粉完全替代原始搖瓶發酵培養基中的冷榨黃豆粉，考察對林可霉素生物合成的影響。結果林可霉素的發酵效價可提高至 4695 μ g/ml ο
[0034]以上實驗表明，復合蛋白粉可以完全替代原始搖瓶培養基中的冷榨黃豆粉，并能提高林可霉素的發酵單位。
[0035]實施例4:復合蛋白粉用于林可霉素發酵罐工藝
[0036]復合蛋白粉的質量百分比組成為:冷榨黃豆粉25%，花生餅粉20%，棉籽蛋白粉15%，魚粉40%。所述復合蛋白粉的總氮含量54%、氨基氮含量13.5%、總磷含量1.8%。
[0037]以原始發酵罐培養基為對照，分別用5g/L、10g/L、15g/L的實施例4的復合蛋白粉替代原始發酵罐培養基配方中的冷榨黃豆粉。同時，稀料培養基中90g/L的冷榨黃豆粉也按相同的比例用30g/L、60g/L、90g/L的實施例4的復合蛋白粉替代。考察在200L發酵罐中，復合蛋白粉對林可霉素發酵是否有促進作用，結果如圖2所示。結果表明，復合蛋白粉替代冷榨黃豆粉后發酵單位較原始發酵罐培養基配方的5900μ g/ml分別提高16%、39%、63%，其中復合蛋白粉完全替代原始發酵罐培養基`配方中15g/L的冷黃豆粉時，林可霉素的發酵單位達到了 9561 μ g/ml。而且利用復合蛋白粉替代冷黃豆粉后，能夠顯著減緩菌絲自溶和提高林可霉素的生物合成速率，從而提高發酵效價(圖3)。從圖3可以看出，用復合蛋白粉替代冷榨黃豆粉進行林可霉素發酵時，在發酵后期能夠保持良好的菌絲狀態要，明顯減少菌絲的斷裂現象(對照組)，從而維持產抗活力提高發酵單位。
【權利要求】
1.林可霉素發酵用復合蛋白粉，其特征在于，其由以下質量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、15%~30%的花生餅粉、10~25%的棉籽蛋白粉和20%~55%的魚粉。
2.根據權利要求1所述的林可霉素發酵用復合蛋白粉，其特征在于，其由以下質量百分比的組分組成:20%~25%的冷榨黃豆粉、20%~25%的花生餅粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的魚粉。
3.根據權利要求1或2所述的林可霉素發酵用復合蛋白粉，其特征在于，所述復合蛋白粉的總氮含量為52.5% -55.5%、氨基氮含量為12.5% -14.5%、總磷含量為.1.6% -1.9%。
【文檔編號】C12P19/64GK103805658SQ201210454439
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月13日 優先權日:2012年11月13日
【發明者】李繼安, 陳代杰, 林惠敏, 藍鴻, 毛全貴, 張宏周 申請人:上海醫藥工業研究院, 河南天方藥業股份有限公司