專利名稱：一種提高喹樂霉素產量的發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵工藝，具體說是一種提高喹樂霉素產量的發酵方法。
背景技術：
粘細菌(Myxobacteria )是一類具有群體習性和復雜發育史的、革蘭氏陰性單細胞的滑行細菌的總稱。粘細菌能產生令人驚奇的多樣的生物活性化合物，早在1947年研究者就粘細菌的發酵液能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長；1973年終于從粘細菌的發酵液中獲得了活性物質——異支鏈脂肪酸；1977年粘細菌產生的Ambruticin的化學結構也被確定，該物質抗真菌能力強。粘細菌產生活性次級代謝產物的幾率特別高，在可以溶解細菌的2000株粘細菌中，有55%的菌株可以產生生理活性物質；在700株可降解纖維素的粘細菌中，95%的菌株可以產生活性物質。在大約7500株已經分離出來的粘細菌中，發現了 100種具有主要骨架和600多種衍生物的化合物，包括芳香類、雜環類、醌類、大環類、聚醚類、多烯類、肽類化合物等。粘細菌產生的活性物質大部分具有抗真菌和抗腫瘤活性，如 Epothilones和Chivosazols等，分別對真核細胞的微管和肌動蛋白起作用，并且2007年美國FDA批準了纖維堆囊菌產生的埃博霉素B的半合成類似物ixabepilone (伊沙匹隆)用于乳腺癌的治療。因此，粘細菌是一類新近引起廣泛關注但卻研究尚少的重要藥源微生物類群。
權利要求
1.一株直立標樁菌，其特征是分類命名為直立標樁菌(份i^sateWa eracta)LY-122，已保藏與中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5514。
2.一種用權利要求1所述的直立標樁菌(份i^sateWa eracta) LY-122生產喹樂霉的一種提高喹樂霉素產量的發酵方法，其特征在于其具體步驟為(1)斜面固體培養將直立標樁菌LStigmatella eracta) LY-122接種在固體斜面培養基上，25 35°C培養21天，得到斜面固體培養的菌種，備用；所述的固體斜面培養基配方為每1000 ml培養基，加入蛋白胨1.0 5.(^、葡萄糖1. 0 5. Og和瓊脂17. Og,余量為水；(2)搖瓶種子培養取上述步驟(1)所制備的斜面固體培養的菌種，加入無菌水制成菌懸液，無菌水的加入量按照一環菌種加入3—5ml ；將菌懸液接種于液體種子培養基中，接種量為液體種子培養基體積的2 10%，培養溫度25 ;35°C，攪拌速度100 200 r/min, pH 7. 0 7. 2，培養時間2 5天，得到搖瓶種子液，備用；所述的液體種子培養基配方為每1000 ml培養基，加入玉米淀粉0. 5 5. 0g、葡萄糖1. 0 10. 0g、酵母粉0. 5 5. 0g、氯化鈣0. 5 2. Og和七水硫酸鎂0. 5 2. 0g，余量為水，pH 7. 0 7. 2 ；(3)發酵罐培養將上述步驟(2)培養好的搖瓶種子液接種于發酵培養基中，接種量為發酵培養基體積的2 10%，培養溫度25 35°C，攪拌速度120 300 r/min，每分鐘通入發酵液的空氣體積與發酵液的體積比為1 :2 1 :10，pH 7.0 7. 2，培養時間5 10天，其中，在發酵培養的第三天分別添加已除菌的乙酸鈉水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液，使其在發酵培養基中終濃度分別達到1. 0 10mg/lU. 0 10 ml/1和1. 0 10mg/l，然后繼續培養，即可得含有喹樂霉素的發酵液；所述的發酵培養基配方如下每1000 ml培養基，加入花生餅粉1. 0 10. 0g、葡萄糖5 15. 0g、玉米漿1. 0 5. 0g、大豆蛋白胨1. 0 5. 0g、氯化鈣0. 5 2. 0g、硫酸鎂0. 5 2. Og和磷酸二氫鉀0. 5 2. Og,余量為水，pH 7. 0 7. 2 ；(4)、喹樂霉素的提取采用離心、萃取、大孔樹脂柱層析和結晶的方法，從上述步驟(3)所得到的含有喹樂霉素的發酵液中提取喹樂霉素。
3.如權利要求2所述的一種提高喹樂霉素產量的發酵方法，其特征在于所述的乙酸鈉水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液的制備方法為準確稱取乙酸鈉IOOmg和甘氨酸IOOmg,量取丙酮酸100ml，分別溶于100ml去離子水中，經0. 45微米濾膜過濾除菌后，備用。
4.如權利要求2所述的一種提高喹樂霉素產量的發酵方法，其特征在于喹樂霉素提取的具體方法為取所制備的發酵液，5000 10000轉/分鐘離心10 15分鐘去沉淀得到上清液，在所得上清液中加入上清液體積的1 3%的乙酸進行酸化處理后，用濾紙過濾，濾液用2倍體積的氯仿萃取，得到的氯仿萃取液加入同等體積的質量濃度為1 3%氫氧化鈉水溶液，靜置1小時，所得的有機溶劑氯仿層通過轉蒸發儀45°C旋轉蒸發去除溶劑，得喹樂霉素的粗提物；然后在室溫下，采用100gHPD300大孔樹脂吸附層析，所使用層析柱為3cmX40cm層析柱，洗脫方法為依次用1倍層析柱體積的體積濃度為5%甲醇、2倍層析柱體積的體積濃度為40%甲醇和2倍層析柱體積的體積濃度為80%乙醇洗脫，收集流出量為2. 5 倍層析柱體積至4倍層析柱體積的洗脫液，洗脫液55°C旋轉蒸發濃縮干燥，干燥物再溶解于體積比為1 :1 2的丙酮和苯混合液中，于4 10°C條件下，靜置1 M小時，析出晶體，晶體45°C干燥后即得純度為85-90%的喹樂霉素。
全文摘要
一種提高喹樂霉素產量的發酵方法，采用一株已保藏與中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5514的直立標樁菌(Stigmatellaeracta)LY-122發酵生產喹樂霉素，通過對直立標樁菌LY-122發酵培養基和發酵條件的改良，并結合添加前體的方法，使喹樂霉素的產量比目前已報道的產量高12-14倍，且產量穩定，基本維持在15mg/l左右，純度可達85-90%；本發明主要使用一些價格低廉的花生餅粉、葡萄糖和玉米漿等作為發酵培養基，同時在發酵過程中不需要加入價格昂貴的XAD-16大孔吸附樹脂，降低了工藝成本；在提取工藝中，采用常見的離心、萃取、大孔樹脂柱層析和結晶等方法，更適合大規模生產。
文檔編號C12P17/18GK102559556SQ201210018410
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者原江鋒, 王大紅 申請人:河南科技大學