專利名稱：用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生化檢測技術及臨床分子診斷領域，特別涉及一種用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法。
背景技術：
分子生物學誕生以來，一直在分子水平上研究生物大分子的結構和功能，以揭示生命的本質。借助探索技術手段不斷升級提高，分子生物學研究所取得的成果已經為人類了解生命起源、遺傳進化、掌握遺傳規律做出了卓越貢獻。核酸作為一類生物大分子在生物遺傳進化中起著舉足輕重的作用，也倍受科學研究者關注。如今圍繞核酸展開的研究種類繁多，所用到的研究技術手段也是日新月異，相關的核酸檢測應用也已經在醫療、科研領域廣泛鋪開。目前，核酸相的檢測在醫療領域中以疾病的臨床分子診斷最具代表性，其檢測快速高效、結果準確率高等優點顯而易見，但由于樣本量大導致操作步驟易出錯、對檢測本身的質控手段單一等缺點也逐漸突顯出來。
醫療科學技術迅速發展，各種診斷、診療的方法不斷推陳出新，使得臨床診斷技術正在向著個體化、數字化、自動化、微量微創、準確度提升等方向發展。為了保證大批量快速檢測結果的真實準確性，必須在整個臨床檢測過程中做好質控措施，以及時的發現并解決問題；避免因為缺少相應質控體系，得出錯誤的檢測結果引起醫療事故。
分子診斷技術不同于以往診療機構所做的生化檢測項目，它代表了未來醫學診斷檢測領域的發展方向，現階段簡單的質量控制措施很難滿足分子診斷要求，診斷檢測結果的真實、準確性無法得到全面保證，從而限制了分子診斷技術在臨床診斷領域全面鋪開和發展。
目前，國內生物相關科研機構及醫院的臨床診斷都具有樣本量大、檢測程序繁瑣， 如果沒有購買程控模塊化自動檢測儀器，則可能在核酸檢測實驗過程中存在較多影響結果準確率的因素，例如較為常見的影響因素有樣本混淆或樣本相互污染等問題。為了排除整個檢測過程中的人為因素干擾等情況，現在較大型的臨床診斷檢測機構都已經參照美國臨床和實驗室標準化研究院(CLSI)MM1-A2文件中所述的步驟將質控以檢測過程劃分，即分析前質控、分析中質控、分析后質控，根據不同階段的要求建立起從樣本采集、分配、檢測、 結果分析等較完整的質控體系；例如分析前質控步驟中對樣本采集識別和驗收，國內醫院普遍采用的識別質控方法是條形碼標識區別，即在收集樣本時，針對每個個體樣本分配一個條形碼并做好對應記錄，在檢測過程中樣本始終保證對應此條形碼。然而，此種質控是宏觀的外部質控方法，面對如今越來越多的分子層級的檢測項目，仍然可能在檢測過程中發生混淆污染等情況，針對樣本相互區分的問題缺乏微觀分子化手段，大大降低了分析前質量控制的效力，影響了整個檢測過程的準確性。由此可，新的質量控制方法對于新興的核酸檢測應用及分子診斷技術重要性顯而易見。
經過調查發現在樣本質控過程中采用構建質控分子內標對樣本進行識別的質控體系，在國內外與核酸檢測相關領域尚處空白階段。在現有的臨床診斷檢測領域也尚無利用分子內標對樣本進行標記，通過后續實驗檢測內標物來區分樣本及樣本相互污染的質控方法。本發明為所面臨的實際問題提供了一條有效的解決途徑。發明內容
本發明所要解決的第一方面技術問題是克服現有與核酸檢測相關領域的空白，提供一種在核酸檢測樣本質控過程中的，以對樣本進行識別、質量監控的生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法。
本發明的所要解決的第二方面技術問題，提供一種試劑盒，其含有上述分子內標序列。
為了解決現有技術中的這些問題，本發明第一方面提供的技術方案是用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法，其特征在于，包括如下步驟(1)采集待測生物樣本備用；(2)制備一條或多條有別于待測樣本核酸序列的特異外源核酸序列，所述的特異外源核酸序列與待測樣本的同源性不高于99%，同一批處理的不同待測樣本分別與不同的特異外源核酸序列混合；(3)將上述的特異外源核酸序列加入采集后未處理的待測樣本并混合均勻，做好對應記錄并一起進行后續處理，完成待測樣本的核酸檢測分析；(4)在需要質控時，可以采用單獨一個反應體系檢測質控分子內標，或采用與待測樣本核酸檢測體系同一個體系對質控分子內標和樣本同時檢測，根據檢測的質控分子內標的信息核對檢測結果是否對應正確的待測樣本。
優選地，步驟(2)中，所述特異外源核酸序列與待測樣本同源性小于80%，連續 40bp堿基以上無同源性。
優選地，步驟(2)中，所述多條特異外源核酸序列彼此存在易于檢測的標記或序列差異，包括如下方面多條特異外源核酸序列彼此僅在局部區域存在個別堿基差異或個別堿基插入或缺失導致的長度差異但在其余區域完全相同的核酸序列，以便于用同一對引物對不同外源核酸序列進行擴增并進行后續檢測分析。
為了解決現有技術中的這些問題，本發明第二方面提供的技術方案是用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控試劑盒，其特征在于，其含有特異外源核酸序列，為與待檢測生物樣本基因組高度非同源性的DNA序列，具有Seq. Nol所示序列。
優選地，所述特異外源核酸序列，為以Seq. Nol序列為基礎定點突變標記的缺失型標記質控分子內標序列或SNP型質控分子內標序列或二者組合。
優選地，所述分子內標序列在Seq. No. I序列基礎上缺失形成，包括如下所述分子內標序列缺失Seq No. I序列的429-430位堿基(CA)，其具有如Seq No. 2所示DNA序列；或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-432位堿基(CATC)，其具有如SeqNo. 3所示DNA序列；或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-434位堿基(CATCTG)，其具有如Seq No. 4所示DNA序列；或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-436位堿基(CATCTGTC)，其具有如 Seq No5所示DNA序列；或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-438位堿基(CATCTGTCAG)，其具有如Seq No. 6所示DNA序列；或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的428-439位堿基(ACATCTGTCAGC)，其具有如Seq No. 7所示DNA序列；所述分子內標序列在Seq. No. I序列基礎上突變形成，包括如下在Seq No. I序列的 488位堿基由(C)突變為(A)，其具有如Seq. No. 8所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的619位堿基由(A)突變為(C)Seq.No. 9所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的632位堿基由(A)突變為⑴Seq.No. 10所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的632位堿基由(A)突變為(C)Seq.No. 11所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的733位堿基由(G)突變為⑴Seq.No. 12所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的733位堿基由(G)突變為(A)Seq.No. 13所示DNA序列；或者所述分子內標序列，在SeqNo.I序列的733位堿基由(G)突變為(C)Seq.No. 14所示DNA序列。
本發明中，“分子內標”是指人工合成的一段DNA序列，有別于待測樣本核酸序列的特異外源核酸序列，所述的特異外源核酸序列與待測樣本的同源性小于99%，而且可在選定的位置上通過定點突變技術，改變堿基構成或讓堿基缺失或個別堿基插入導致長度差異但在其余區域完全相同的核酸序列。
本發明中，“堿基缺失”是指在制備分子內標物時，在選定位置處去除該處堿基， 其它位置不變的情況。在本發明中選擇了缺失2、4、6、8、10bp，也可以缺失任意堿基數，理論上只要能在后期檢測中，通過核酸片段長度分析得出相互之間的差異即可達到標記目的。 但因為檢測技術局限，如果兩種分子內標相互只有一個堿基的差異且出現同一體系中時， 在片段長度分析時會造成信號相互干擾，難以區分。當然在符合本發明目的的基礎上，還可以設計選擇使用其他的堿基缺失質控分子內標序列。
本發明中，“SNP型質控分子內標序列”是指在制備分子內標物時，滿足PCR條件的一段序列，SNP位點之間不要相距太近，不要設計在引物位置上即可。本發明的試劑盒中采用的就是在401bp的長度中，選了四個點進行突變，當然，在符合本發明目的的基礎上， 還可以設計選擇使用其他的SNP型質控分子內標序列。
本發明中，“質控系統”或”質控方法”是指針對區分核酸等樣本時加入人為設計合成的帶有突變或缺失標記物(標記核酸序列)，在該樣本需要做識別質量控制時，可以通過核酸分子檢測的方法(如測序、片段長度分析等)來識別標記物，從而達到驗證樣本及是否存在相互污染等情況，包括通過擴增、片段長度分析、SNP分型、多重熒光PCR、毛細管電泳、測序等常用技術即可獲取內標物信息用以驗證樣本，簡單易行地完成樣本識別及驗收等質控環節。
本發明中，“生物樣本核酸檢測”包括常規的生化實驗各種操作，如各種PCR、各種電泳、SNP分型、STR分析、片段長度分析、插入缺失檢測、基因拷貝數檢測、基因突變檢測、 測序等涉及到核酸的分子生物學檢測實驗本發明技術方案在總結了現有各種宏觀及微觀質控體系優缺點的基礎上，利用DNA合成、定點突變、基因克隆等技術制備了分子內標物，并且應用于分子診斷樣本標識質量控制體系中，通過片段長度分析、SNP分型、多重熒光PCR、毛細管電泳等常用技術即可獲取內標物信息用·以驗證樣本，簡單易行地完成樣本識別及驗收等質控環節。在保證分子診斷檢測結果高準確率的前提下，以較低的成本，極大的提高了質控可靠性。預計該技術在未來分子診斷領域及臨床診斷檢測領域將會有廣泛的應用前景。
相對于現有技術中的方案，本發明的優點是I.在生物樣本核酸檢測包括臨床分子診斷過程中，以分子內標的形式在分子層級上標記樣本，在檢測過程結束后，可以通過簡單的驗證分子內標實驗，完成樣本識別及污染等質控步驟。
2.在分子層面上，建立起對樣本標記、識別等質控體系，填補了國內外生物樣本核酸檢測包括臨床診斷領域內相關質控體系的空白，為體外診斷檢測建立標準化質控系統提供可選措施。
3.在檢測過程中，可單獨檢驗分子標記完成質控；也可在同一體系內同時完成樣本的核酸檢測實驗分析和分子標記檢測質控。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖I為應用本發明分子內標物的質控檢測方法。
圖2為單獨檢測三個不同樣本缺失型分子內標物的檢測結果。
圖3為三個樣本STR分析與分子內標物的檢測結果。
圖4為SNP型內標突變位點測序結果。
具體實施方式
以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
以下將以舉例形式進行說明，如有未詳盡之處，可以參見常用的實驗手冊，如《分子克隆實驗手冊》以及所用試劑和儀器的廠商說明書。本發明涉及的人工序列DNA及涉及的堿基缺失、堿基突變序列等是由金唯智公司合成。
實施例I .分子內標的制備1.I原始序列的設計使用 Random DNA Sequence在線生物學軟件(http://www. bioinformatics, org/sms2/ random_dna. html)設計了一段長1380bp的DNA序列，如Seq No. I所示,此序列GC含量在O. 4到O. 6之間，通過NCBI數據庫基因組同源性比對后，確認在連續40bp以上無同源序列，即保證在任何生物體中都不存在所設計的此段序列。
I. 2對Seq No. I序列進行基因定點突變人工合成DNA的方法合成此段序列作為模板，利用定點突變技術改變此DNA序列特定位置的堿基以達到序列標記的作用，即在特定位置處利用定點突變技術設計6種缺失不同堿基數量(缺失2bp、4bp、6bp、8bp、10bp和12bp的標記序列)的內標和在4個不同位置堿基處設計了 SNP突變位點型內標序列備用，上述序列及包含有相應序列的內標序列由金唯智公司合成或制備。
這些標記序列序列可以通過排列組合方法加大可標記樣本數量。理論上缺失型的分子內標通過排列組合，可以有64種不同組合；SNP型的內標選取2個位點的組合共有32 個不同組合；可一次性在同一批樣本中標記95樣。
實施例2.分子內標標記方法樣本以人全血為例2.I全血樣本的來源或制備醫院抽血于采血管內即可，在采集后未進行任何后續操作處理；2.2缺失型分子內標序列I、II、III的制備2.3分子內標標記方法(1)按比例在三例樣本原管200ul全血樣本中分別加入O.05ng的缺失型分子內標I、II、III，做好樣本與內標對應記錄，然后進行下列DNA抽提步驟(采用QIAGEN的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒)；(2)取20ulQIAGEN蛋白酶或者蛋白酶K加到1.5ml離心管的底部；(3)加入200ul樣本(全血、血漿、血清、血沉黃層、或者溶于200ulPBS中的5X106個淋巴細胞)如果樣本不足200ul,用PBS補足，QIAamp Mini spin columns會同時提取出樣本中的RNA和DNA，RNA不會抑制PCR，但是可能會抑制某些酶促反應，為了除去RNA，我們可以在加buffer AL前在樣本中加入4ul RNase A儲存液(100mg/ml)。注意也可以在離心管中先加樣本后加蛋白酶，但是要保證充分混勻；(4)加200ulbuffer AL，間歇漩渦振蕩15s使裂解充分；(5)56°C水浴lOmin，延長時間并不會提高產量或質量；(6)加200ul無水乙醇，間歇漩渦振蕩15s使混勻，簡單離心；(7)將上述混合物小心轉移到QIAampMini spin column中，不要沾濕管口，蓋上蓋子， 6000g (8000rpm)離心lmin，如果液體沒有全部通過離心柱請增大離心力再次離心直至液體全部通過離心柱，將QIAamp Mini spin column轉移到新的2ml離心管中(試劑盒提供);(8)打開蓋子小心加入500ulbuffer AW1，不要沾濕管口，蓋蓋6000g (8000rpm)離心 lmin,將QIAamp Mini spin column轉移到新的2ml離心管中(試劑盒提供)；(9)打開蓋子，小心加入500ulbufferAff2,不要沾濕管口，20000g (14000rpm)離心 3min ；(10)把QIAampMini spin column轉移到新的2ml離心管(自備)中全速離心lmin以除去可能殘留的buffer Aff2(11)將QIAampMini spin column轉移到新的I. 5ml離心管(自備)中，小心打開管蓋，加入200ul buffer AE或者蒸懼水,室溫孵育lmin,6000g (8000rpm)離心lmin。其中， a.加入buffer AE或者蒸懼水后室溫孵育時間延長至5min可以提高DNA產量；b.可使用另外200ul buffer AE或者蒸餾水進行第二次洗脫可以增加最多15%的DNA產量；c. I. 5ml 離心管中洗脫時單次洗脫體積不得多于200ul，否則離心管底會接觸到洗脫后的液體，這可能會產生霧氣；d.使用少于200ul的洗脫液會顯著提高獲得的DNA濃度，同時稍微降低DNA 產量，如果預期DNA產量少于lug，建議使用50ul的洗脫液進行洗脫；e.每次使用IOOul 洗脫液洗脫兩次和使用200ul洗脫液洗脫一次相比并不能提高DNA產量。
所抽提到的DNA可用于核酸檢測實驗。
實施例3.獨立內標質控檢測在需要對樣本中內標進行單獨檢測時，取Iul樣本，進行PCR反應，反應總體積為10 微升(IyL IOX PCR緩沖液(Qiagen公司)，0.2yL 25mmol氯化鎂、I μ L檢測內標引物、 O. 8 μ L 2. 5mmol dNTP>0. 04 μ L HotStarplus Taq 酶(Qiagen 公司)，5· 96 μ L ddH20)。PCR 反應條件設置如下95° ClO分鐘；7個循環的Touchdown程序(94° C 20秒，65°C-I 40 秒和 72。C 2min), 28 個循環擴增(94° C 20 秒，63°C 30 秒和 72。C2min)，在 72。C 延伸2分鐘；缺失型內標引物序列如Seq No. 16. 17所示IMMLABF 5/ -TTTTATCATGGCGCCCTCACTT-3'，IMMLABR5' - CCTTAGCGAAGGGCGTAGGAGT -3'。
PCR反應完成后，將PCR擴增產物稀釋20倍，取出Iul加入8. 9ul HIDI和O. Iul LIZ,混勻后95°C 5min，毛細管電泳上樣；因所用檢測內標引物帶有熒光，通過毛細管電泳分離不同長度的擴增片斷，以熒光檢測系統分析結果得出分子內標信息(如圖2所示)，即可與原記錄對比，完成質控。
實施例4.樣本與分子內標同一體系中同時檢測(以三個樣本STR檢測為例) 同樣使用對應的檢測缺失型內標引物與樣本微衛星分析PCR熒光引物按比例混合制成引物Mix。取Iul樣本，進行PCR反應，反應總體積為10微升(I μ L IOX PCR緩沖液(Qiagen 公司)，0· 2μ L 25mmol 氯化鎂、I μ L 引物 Mix、0. 8 μ L 2. 5mmol dNTP.O. 04 μ L HotStarplus Taq 酶(Qiagen 公司)，5· 96 μ L ddH20)。PCR 反應條件設置如下:95。ClO 分鐘-J個循環的Touchdown程序(94° C 20秒，65°C -I 40秒和72° C 2min), 28個循環擴增(94° C 20秒，63°C 30秒和72° C2min)，在72° C延伸2分鐘；缺失型內標引物序列為 IMMLABF 5' -TTTTATCATGGCGCCCTCACTT-3'，IMMLABR: 5' - CCTTAGCGAAGGGCGTAGGAGT -3/ 。
PCR反應完成后，將多重PCR產物稀釋20倍后取Iul加入8. 9ul Hi-Di和0. Iul LIZ500的Mix中，混勻后95°C 5min變性后上測序儀進行熒光毛細管電泳。
通過電泳分離不同長度片段后，熒光檢測系統分析實驗結果，除樣本實驗數據外， 還可同時得到內標物信息，與原加入內標記錄對比即可完成質控；如圖3所示的三個樣本STR分析與分子內標同時檢測的結果。
表一三個樣本STR信息
權利要求
1.用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)采集待測生物樣本備用； (2)制備一條或多條有別于待測樣本核酸序列的特異外源核酸序列，所述的特異外源核酸序列與待測樣本的同源性不高于99%，同一批處理的不同待測樣本分別與不同的特異外源核酸序列混合； (3)將上述的特異外源核酸序列加入采集后未處理的待測樣本并混合均勻，做好對應記錄并一起進行后續處理，完成待測樣本的核酸檢測分析； (4)在需要質控時，可以采用單獨一個反應體系檢測質控分子內標，或采用與待測樣本核酸檢測體系同一個體系對質控分子內標和樣本同時檢測，根據檢測的質控分子內標的信息核對檢測結果是否對應正確的待測樣本。
2.根據權利要求I中所述的分子內標質控方法，其特征在于，步驟(2)中，所述特異外源核酸序列與待測樣本同源性小于80%，連續40bp堿基以上無同源性。
3.根據權利要求I中所述的分子內標質控方法，其特征在于，步驟(2)中，所述多條特異外源核酸序列彼此存在易于檢測的標記或序列差異，包括如下方面多條特異外源核酸序列彼此僅在局部區域存在個別堿基差異或個別堿基插入或缺失導致的長度差異但在其余區域完全相同的核酸序列，以便于用同一對引物對不同外源核酸序列進行擴增并進行后續檢測分析。
4.用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控試劑盒，其特征在于，其含有特異外源核酸序列，為與待檢測生物樣本基因組聞度非同源性的DNA序列，具有Seq. Nol所不序列。
5.根據權利要求4中所述的分子內標質控試劑盒，其特征在于，所述特異外源核酸序列，為以Seq. Nol序列為基礎定點突變標記的缺失型標記質控分子內標序列或SNP型質控分子內標序列或二者組合。
6.根據權利要求5中所述的分子內標質控試劑盒，其特征在于，所述分子內標序列在Seq. No. I序列基礎上缺失形成，包括如下 所述分子內標序列缺失Seq No. I序列的429-430位堿基(CA)，其具有如Seq No. 2所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-432位堿基(CATC)，其具有如SeqNo. 3所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-434位堿基(CATCTG)，其具有如SeqNo. 4所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-436位堿基(CATCTGTC)，其具有如Seq No5所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的429-438位堿基(CATCTGTCAG)，其具有如Seq No. 6所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，缺失Seq No. I序列的428-439位堿基(ACATCTGTCAGC)，其具有如Seq No. 7所示DNA序列； 所述分子內標序列在Seq. No. I序列基礎上突變形成，包括如下在Seq No. I序列的·488位堿基由(C)突變為(A)，其具有如Seq. No. 8所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，在Seq No. I序列的619位堿基由(A)突變為(C)，其具有如Seq. No. 9所示DNA序列； 或者所述分子內標序列，在SeqNo. I序列的632位堿基由(A)突變為(T)，其具有如Seq. No. 10 所示 DNA 序列； 或者所述分子內標序列，在SeqNo. I序列的632位堿基由(A)突變為(C)，其具有如Seq. No. 11 所示 DNA 序列； 或者所述分子內標序列·，在SeqNo. I序列的733位堿基由(G)突變為(T)，其具有如Seq. No. 12 所示 DNA 序列； 或者所述分子內標序列，在SeqNo. I序列的733位堿基由(G)突變為(A)，其具有如Seq. No. 13 所示 DNA 序列； 或者所述分子內標序列，在SeqNo. I序列的733位堿基由(G)突變為(C)，其具有如Seq. No. 14 所示 DNA 序列。
全文摘要
本發明所要解決的問題在于提供一種用于生物樣本核酸檢測的分子內標質控方法及試劑盒以對樣本進行識別、檢測分析等質量監控，質控分子內標是一類區別于待測樣本的核酸序列的特異外源核酸序列，其與待測樣本的同源性不高于99%，將上述的特異外源核酸序列與待測樣本混合均勻，做好對應記錄并一起進行后續處理。本發明利用DNA合成、定點突變、基因克隆等技術制備了質控分子內標，并且應用于生物樣本核酸檢測的標識質量控制體系中，通過擴增、片段長度分析、SNP分型、多重熒光PCR、毛細管電泳、測序等常用技術即可獲取質控分子內標信息用以驗證樣本，簡單易行地完成樣本識別及驗收等質控環節。
文檔編號C12Q1/68GK102978283SQ20121047188
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者姜正文, 李才華, 張希 申請人:天昊生物醫藥科技(蘇州)有限公司