專利名稱：花生種間雜交品種的獲得、繁殖保存與分子細胞學鑒定方法
技術領域：
本發明涉及花生育種技術，特別是涉及花生種間雜交品種F1的獲得、繁殖保存和分子細胞學鑒定方法。
背景技術：
栽培花生在馴化過程中遺傳多樣性不斷降低，可利用的基因資源有限。特別是近年來集約化品種的選育和廣泛應用，使得花生品種的遺傳基礎變得越來越狹窄，生產受到各種病蟲害及逆境(旱、澇、鹽堿、低溫)的脅迫，造成花生品質的降低和產量下降。如何提高 花生對病蟲和逆境的抗性及產量，已成為目前花生育種工作的主要目標。花生屬包括大約80個種，為一年生或多年生物種，基于形態學、雜交親和性等將花生屬劃分為9個區組，12個染色體組。這些野生物種由于經受各種環境的鍛煉和考驗，形成許多優異基因，而大量花生栽培品種在長期的人工馴化與栽培下已逐漸失去或不具備這些優異基因。利用祖先物種或外源遺傳資源創制外源染色體小片段易位或外源等位基因漸滲，將花生野生種有利基因轉移至栽培品種，可以增加栽培種資源的遺傳多樣性，對創制優良新種質和培育新品種具有重要意義。染色體帶型技術和原位雜交技術為種間雜種鑒定提供了技術基礎。栽培花生由A、B兩個染色體組組成，A染色體組有一對特征小染色體。采用DAPI熒光染料對染色體進行熒光顯帶，可以區分染色體上不同類型的異染色質。經DAPI染色后，A染色體組染色體均有明亮的著絲粒帶，B染色體組染色體沒有明顯的DAPI+帶紋，可以初步將花生的A、B染色體組分開。核糖體RNA基因(rDNA)是高度保守的重復序列，成簇分布在一對或多對染色體上。利用45S、5S rDNA為探針進行原位雜交，能有效識別帶有核仁組織區的隨體染色體。受制于種間雜交不親和性，花生屬許多種之間雜交很難得到發育健全具有生活力的種子(胚珠)，而且種間雜種F1高度不育不實，無法延續世代；同時花生與野生種之間染色質異質性差，為種間雜種鑒定帶來了困難。為開發和利用花生野生種的基因資源，申請人多年從事花生野生資源及其遠緣雜交技術的研究，在克服花生遠緣雜交不育不實和有效利用野生種質方面獲得了較大突破，通過胚珠、幼胚離體培養及染色體倍性操作等技術，育成了一批優質、抗病性材料，已通過審定品種3個，其中遠雜9102無論是產量、品質、抗性都優于目前推廣的同類品種，已成為河南省的主導花生品種，也是我國目前唯一一個通過國家及多個省份審(認)定的推廣范圍最廣、種植面積最大的花生種間雜交品種。

發明內容
本發明要解決的技術問題克服背景技術中的缺陷，提供一種花生種間雜種F1的培育、繁殖、保存和分子細胞學鑒定方法。通過胚珠、幼胚培養和其它組織培養，獲得了種間雜種F1植株，解決了 F1植株繁衍和長期保存問題；并綜合利用細胞學和分子標記技術對雜種匕的真實性實施鑒定，為轉移和利用花生野生種的優良基因提供了技術保障。
本發明的技術方案
花生種間雜種F1的獲得方法，是以栽培種白沙1016為母本，以野生種A macedoi為父本，進行人工雜交，經過胚珠和幼胚離體培養得到雜種F1，具體包括
Cl)人工雜交在白沙1016與A. macedoi的始花期，每天下午16:00-18:00，選取母本的花萼微裂花蕾，用鑷子輕輕撥開花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的節位上作標記；第二天上午收集父本花，取其 花粉，用鑷子將花粉涂在所述去除雄蕊花朵的母本植株柱頭上；經施肥、澆水，60-80天后收獲莢果；
(2)胚珠與幼胚離體培養
將所得的莢果消毒處理，取其胚珠，將胚珠接種到由MS、0. 075mg/L ΙΑΑ、0. 01 mg/L Kn和5%鹿糖組成的固體培養基中，置于25°C恒溫光照培養間培養；胚珠萌發后及時解剖出幼胚，并進行連續繼代培養40-60天，待幼胚發育成F1幼苗；然后將F1幼苗移至由MS、0. 8ppmNAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，在25°C恒溫光照培養間中培養，最后形成根莖葉完整的F1植株。所述莢果消毒處理包括用清水將莢果表面沖洗干凈，用5%的次氯酸鈉將莢果表面消毒10-15分鐘，然后在超凈工作臺下用無菌水漂洗莢果2-3次，每次5-8分鐘；在滅菌紙上用鑷子打開莢果果殼，測量并記錄莢果、胚珠的長度和發育狀況。花生種間雜種F1的繁殖和保存方法，包括如下步驟
(O從超凈工作臺下的培養基中取出F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片葉子，將幼苗頂芽區段置于由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，培養15-30天，直至獲得完整的植株；
(2)將幼苗除頂芽外的其它區段置于由MS、0. I mg/L ΝΑΑ、0· 4 mg/L 6-BA和3%蔗糖組成的固體培養基中，在25°C恒溫光照培養間中誘導芽分化15-30天；然后接種到由MS、0. 8mg/L NAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，培養15-30天，直至形成完整植株；
重復以上兩個步驟，繁殖并長期保存雜種匕。花生種間雜種F1的分子細胞學鑒定方法，包括以下步驟
Cl)分別提取母本白沙1016、父本A macedoi和雜種F1植株的基因組DNA ；
(2)利用白沙1016和Amacedoi的特異標記E66進行PCR反應，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；
進行PCR反應和PCR擴增，反應結束后向PCR擴增產物中加入2 μ 變性的LoadingBuffer，經8%的聚丙烯酰氨凝膠電泳l_2h，用硝酸銀染色，在凝膠成像儀上照相觀察；根據特異標記E66在雜種F1上是否有無親本特異擴增條帶，鑒定F1雜種的真實性；
所述特異標記E66包括SSR引物左側序列和右側序列，SSR引物左側序列為TCCTTCCCACAATAACAATGAA，
SSR 引物右側序列為GAGGAGAAAACATGGCCTAAAA ;
(3)父本、母本及F1染色體數目的確定及基因組原位雜交分析取父本、母本及組織培養的F1的健康根尖在有絲分裂中期制片，分別用突光素標記A acet/oi全基因組DNA和5SrDNA探針，用地高辛標記45S rDNA探針，對白沙1016、A macedoi和F1進行熒光原位雜交；用DAPI染色3-4 min，用熒光顯微鏡照相，根據熒光信號在染色體上的分布統計染色體的數目，進一步鑒定F1雜種的真實性。
所述PCR反應的體積為10 μι，成分包括25 ng/ml的基因組DNA模板0.9 μ 、10 μΜ的SSR引物右側序列O. 2 μ1、10 μΜ的SSR引物左側序列O. 2 μ1、 μ1的10XPCRbuffer,2. 5 mM 的 dNTP O. 9 μ1、25 mM 的 MgCl2 O. 8 μ1、0· 5U 的 Taqase O. I μ 和余量的ddH20 ；
所述PCR擴增的程序為94°C預變性3 min，94°C變性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I. 2 min, 33 個循環后 72°C延伸 10 min。所述熒光原位雜交的方法如下
先配制雜交液，雜交液成分為去離子甲酰胺7. 5Pl、20XSSC緩沖液I. 5μ1、50%的硫酸葡聚糖2 Pl、10mg/ml的鮭魚精DNA O. 5 μ1、 ΝΑ探針2 μ1、100 mg/ml的白沙1016封阻DNA2 μ ，將雜交液混勻后，103°C變性13 min，然后將雜交液立即置于碎冰中冰浴10-15min，在有絲分裂中期制片，_70°C冰凍揭片，酒精脫水后在78°C、70%的甲酰胺中變性I min 10 s,立即置于-20°C 70%、95%、100%的酒精中梯度脫水各5 min，吹干載玻片；將所述雜交液滴到 載玻片上，蓋上蓋玻片，于37°C雜交6-8 h ；
所述熒光原位雜交方法還包括雜交后的洗滌步驟
室溫下用2XSSC浸泡所述制片，使蓋玻片和載玻片分離，然后按下列程序洗滌制片42°C條件下分別用2XSSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2XSSC浸泡10 min，室溫下用IXPBS浸泡5 min ;將制片浙干，放入37°C暗盒中室溫培育30 min，用IXPBS室溫洗滌制片3次，每次5 min，最后將制片吹干。本發明的積極有益效果
(O本發明的花生種間雜種F1獲得方法中，以栽培種白沙1016為母本，以野生種Amacedoi為父本，進行人工雜交，經過胚珠和幼胚離體培養得到雜種F1。該方法為開發和利用花生野生種的基因資源，在克服花生遠緣雜交不育不實和有效利用野生種質方面獲得了較大突破。(2)本發明花生種間雜種F1的培育繁殖和保存方法，通過胚珠、幼胚培養和其它組織(器官，如莖段)培養，從行將敗育的胚珠中獲得種間雜種F1植株。該方法不但克服了種間雜交的不親和性，而且使雜種F1得到繁殖和長期保存，為轉移和利用花生野生種的優良基因提供了便利條件。(3)本發明的花生種間雜種F1的分子標記方法，明確了白沙1016和A macedoi的特異性標記，利用該分子標記結合花粉活力測定和細胞學技術成功鑒定了雜種匕。(4)本發明得到的雜種F1可作為遺傳育種研究的材料，通過自交或與栽培種回交，創造染色體附加系、代換系或培育新種質，也可用來進行染色體組加倍獲得新材料。(5)本發明形成了一套完整的花生種間雜種的培育、繁殖、保存和鑒定方法，對豐富花生品種的遺傳基礎，優化育種技術發揮將發揮重要的積極作用。


圖I特異標記E66分別在母本白沙1016、父本A macedoi和雜種F1中的擴增結果O可看出，母本(白沙1016)在約170bp處有特異條帶,父本(A acet/oi)在約130bp處有特異條帶，而雜種F1在170bp、130bp處均有特異條帶，說明雜種F1既有來自母本的染色質，又有來自父本的染色質。圖2父本、母本及雜種F1的熒光原位雜交鑒定結果。圖2a :白沙1016的DAPI+染色結果，可看出白沙1016為42條染色體(栽培花生一對大隨體染色體，在細胞學制片中由于次縊痕通常被拉成絲狀，一條染色體在影像上表現為4條，實為40條)，A組染色體有著絲粒帶；
圖2b :用綠色突光素標記A macedoi全基因組探針對白沙1016進行突光原位雜交，可看出A組染色體有雜交信號,表明A. macedoi與白沙1016的A組染色體親緣關系近；圖2c -J. macedoi的DAPI+染色結果,可看出A macedoi有染色體著絲粒帶,有24條染色體(有2對隨體染色體，在細胞學制片中由于次縊痕通常被拉成絲狀，一條染色體在影像上表現為8條，實為20條)；
圖2d:分別用地高辛和綠色熒光素標記45S rDNA和5S rDNA探針，用抗地高辛羅丹明檢測信號對A fflacet/oi進行突光原位雜交,發現A acet/oi有兩對隨體染色體；
圖2e :雜種F1的DAPI+染色結果，可看出雜交種F1有33條染色體(有3條隨體染色體，在細胞學制片中由于次縊痕通常被拉成絲狀，一條染色體在影像上表現為6條，實為30條)；
圖2f :用綠色突光素標記A macedoi全基因組探針對雜種F1進行突光原位雜交,可看出A組染色體和來自A macedoi的外緣染色體有雜交信號，表明F1是母本(白沙1016)和父本(A macedoi )的雜種，為三單倍體。圖3雜種F1減數分裂I期終變期染色體聯會情況。可看出染色體有30條，出現了單價體、二價體和三價體，說明白沙1016和A染色體之間有染色體配對，兩染色體之間存在同源或部分同源關系。
具體實施例方式以下實施例是為了進一步說明本發明，并不表示對本發明的任何限制。如沒有特別說明，其中的百分比均為質量百分比。實施例I、花生種間雜種F1的獲得方法
以栽培種白沙1016 (河南省農業科學院經濟作物研究所保存)為母本，以野生種Amacedoi (由中國農業科學院油料作物研究所引進)為父本，進行人工雜交，經過胚珠和幼胚離體培養得到雜種F1，具體步驟如下
(I)人工雜交
在在白沙1016與A. macedoi的始花期，每天下午16 :00-18:00，選取母本的花萼微裂花蕾，用鑷子輕輕撥開花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的節位上作標記；第二天上午收集父本花，取其花粉，用鑷子將花粉涂在去除雄蕊花朵的母本植株柱頭上；經過常規施月巴、澆水，果針露出后固定枝條等措施，60-80天后收獲，觀察雜交花朵所結莢果。(2)胚珠與幼胚離體培養
雜交莢果收獲后，將莢果用自來水洗干凈，用5% (質量含量)的次氯酸鈉對莢果進行表面消毒10-15分鐘，然后在超凈工作臺下用無菌水洗莢果2-3次，每次5-8分鐘；在滅菌紙上用鑷子打開莢果果殼，測量并記錄莢果、胚珠的長度和發育狀況；
本例取七個莢果，平均果殼長17. 71mm，其中有11粒胚，平均胚株長6. 18mm (見表1)，均為未成熟胚珠。表I白沙1016與A macedoi雜種F1的莢果與胚珠長度(mm)
權利要求
1.花生種間雜種F1的獲得方法，其特征在于，以栽培種白沙1016為母本，以野生種Amacedoi為父本，進行人工雜交，經過胚珠和幼胚離體培養得到雜種F1，具體包括 Cl)人工雜交在白沙1016與A. macedoi的始花期，每天下午16:00-18:00，選取母本的花萼微裂花蕾，用鑷子輕輕撥開花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的節位上作標記；第二天上午收集父本花，取其花粉，用鑷子將花粉涂在所述去除雄蕊花朵的母本植株柱頭上；經施肥、澆水，60-80天后收獲莢果； (2)胚珠與幼胚離體培養 將所得的莢果消毒處理，取其胚珠，將胚珠接種到由MS、0. 075mg/L ΙΑΑ、0. 01 mg/L Kn和5%鹿糖組成的固體培養基中，置于25°C恒溫光照培養間培養；胚珠萌發后及時解剖出幼胚，并進行連續繼代培養40-60天，待幼胚發育成F1幼苗；然后將F1幼苗移至由MS、0. 8ppmNAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，在25°C恒溫光照培養間中培養，最后形成根莖葉完整的F1植株。
2.根據權利要求I所述的獲得方法，其特征在于所述莢果消毒處理包括，用清水將莢果表面沖洗干凈，用5%的次氯酸鈉將莢果表面消毒10-15分鐘，然后在超凈工作臺下用無菌水漂洗莢果2-3次，每次5-8分鐘；在滅菌紙上用鑷子打開莢果果殼，測量并記錄莢果、胚珠的長度和發育狀況。
3.—種權利要求I所述的花生種間雜種F1的繁殖和保存方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (O從超凈工作臺下的培養基中取出F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片葉子，將幼苗頂芽區段置于由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，培養15-30天，直至獲得完整的植株； (2)將幼苗除頂芽外的其它區段置于由MS、0. I mg/L ΝΑΑ、0· 4 mg/L 6-BA和3%蔗糖組成的固體培養基中，在25°C恒溫光照培養間中誘導芽分化15-30天；然后接種到由MS、0. 8mg/L NAA和3%蔗糖組成的固體生根培養基中，培養15-30天，直至形成完整植株； 重復以上兩個步驟，繁殖并長期保存雜種匕。
4.花生種間雜種F1的分子細胞學鑒定方法，其特征在于該方法包括如下步驟 Cl)分別提取母本白沙1016、父本A macedoi和雜種F1植株的基因組DNA ； (2)利用白沙1016和Amacedoi的特異標記E66進行PCR反應，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析； 進行PCR反應和PCR擴增，反應結束后向PCR擴增產物中加入2 μ 變性的LoadingBuffer，經8%的聚丙烯酰氨凝膠電泳l_2h，用硝酸銀染色，在凝膠成像儀上照相觀察；根據特異標記E66在雜種F1上是否有無親本特異擴增條帶，鑒定F1雜種的真實性； 所述特異標記E66包括SSR引物左側序列和右側序列，SSR引物左側序列為TCCTTCCCACAATAACAATGAA， SSR 引物右側序列為GAGGAGAAAACATGGCCTAAAA ; (3)父本、母本及F1染色體數目的確定及基因組原位雜交分析取父本、母本及組織培養的F1的健康根尖在有絲分裂中期制片，分別用突光素標記A acet/oi全基因組DNA和5SrDNA探針，用地高辛標記45S rDNA探針，對白沙1016、A macedoi和F1進行熒光原位雜交；用DAPI染色3-4 min，用熒光顯微鏡照相，根據熒光信號在染色體上的分布統計染色體的數目，進一步鑒定F1雜種的真實性。
5.如權利要求4所述的分子細胞學鑒定方法，其特征是所述PCR反應的體積為10μ ，成分包括25 ng/ml的基因組DNA模板0.9 μ1、10 μΜ的SSR引物右側序列O. 2 μ 、10 μΜ 的 SSR 引物左側序列 O. 2 μ1、 μ1 的 10XPCR buffer、2. 5 mM 的 dNTP O. 9 μ1、25mM 的 MgCl2 O. 8 μ1、0· 5U 的 Taqase O. I μ 和余量的 ddH20 ； 所述PCR擴增的程序為94°C預變性3 min，94°C變性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I. 2 min, 33 個循環后 72°C延伸 10 min。
6.如權利要求4所述的分子細胞學鑒定方法，其特征是所述熒光原位雜交的方法如下 先配制雜交液，雜交液成分為去離子甲酰胺7. 5Pl、20XSSC緩沖液I. 5μ1、50%的硫酸葡聚糖2 Pl、10mg/ml的鮭魚精DNA O. 5 μ1、 ΝΑ探針2 μ1、100 mg/ml的白沙1016封阻DNA2μ ，將雜交液混勻后，103°C變性13 min，然后將雜交液立即置于碎冰中冰浴10-15min，在有絲分裂中期制片，_70°C冰凍揭片，酒精脫水后在78°C、70%的甲酰胺中變性I min 10 s,立即置于-20°C 70%、95%、100%的酒精中梯度脫水各5 min，吹干載玻片；將所述雜交液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，于37°C雜交6-8 h。
7.如利要求6述的分子細胞學鑒定方法，其特征是所述熒光原位雜交方法還包括雜交后的洗滌步驟 室溫下用2XSSC浸泡所述制片，使蓋玻片和載玻片分離，然后按下列程序洗滌制片,42°C條件下分別用2XSSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2XSSC浸泡,10 min，室溫下用IXPBS浸泡5 min ;將制片浙干，放入37°C暗盒中室溫培育30 min，用IXPBS室溫洗滌制片3次，每次5 min，最后將制片吹干。
全文摘要
本發明涉及花生種間雜交品種F1的獲得、繁殖保存和分子細胞學鑒定方法。以栽培種白沙1016為母本、野生種A.macedoi為父本進行人工雜交，經胚珠和幼胚離體培養得到F1；繁殖時將幼苗頂芽區段置于固體生根培養基中，培養成完整植株；鑒定時分別提取母本、父本和雜種F1的基因組DNA，利用母本、父本的特異標記E66進行PCR反應，并進行凝膠電泳分析，鑒定雜種F1的真實性。本發明方法為開發和利用花生野生種基因資源方面獲得較大突破，克服了種間雜交的不親和性，使雜種F1得到繁殖和長期保存，為轉移和利用花生野生種的優良基因提供了便利條件，利用特異性標記結合和細胞學技術成功鑒定了雜種F1，對豐富花生品種的遺傳基礎和優化育種技術將發揮重要的積極作用。
文檔編號C12Q1/68GK102960237SQ20121047612
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者張新友, 杜培, 徐靜, 秦利, 黃冰艷, 董文召 申請人:河南省農業科學院