專利名稱：一種能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株及其構建方法、蛋白表達純化方法和蛋白應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組菌株及其構建方法、蛋白表達純化方法和蛋白應用。
背景技術：
金針 免疫調節蛋白(fungal immunomodulatory protein from flammulinavelutipes，FIP-fve)是從金針菇中分離獲得的非特異性免疫增強劑，對機體免疫具有雙向調節作用，具有免疫調節、抗癌癥、抗過敏等活性，特別是通過調節體內細胞因子含量和維持平衡的角度起到預防和治療過敏癥的目的，具有副作用小、標本兼治的優勢。作為不含糖基的小分子單純蛋白質，金針菇免疫調節蛋白方便操作與應用，是非常有前景的可應用于臨床的藥用蛋白，因此將其開發成抗過敏產品造福人類很有必要。但由于金針菇生產周期長，天然FIP-fve含量極微，產率不足90mg/kg，且分離成本極高，所以通過其他生物反應器生產該蛋白是其走上應用的有效途徑。目前國內外幾家研究機構也對其進行了原核和真核表達，但是普遍存在原核表達率低、多數形成不溶性的包涵體或可溶性蛋白所占比例較小，不能形成正確的二級結構或以不溶性的包涵體形式存在，需要變性復性處理影響生物活性，不適合開發應用。真核表達雖然有較高的表達率和能形成糖基化結構，但是發酵工藝復雜、成本高、細胞培養誘導表達蛋白時采用甲醇等有害試劑、操作繁瑣，而且表達蛋白糖基化程度過高，與天然蛋白不符，結構不確定，產物不純，有多種不同的形式，活性難以穩定，另外因沒有純化標簽，純化工藝復雜，成本過高。

發明內容
本發明的目的是為了解決現有金針菇免疫調節蛋白工程菌株表達率低，表達產物多為不溶性的包涵體，結構不確定以及菌體破碎率低、純化工藝復雜不適合大規模生產應用的一個或多個問題，而提供一種能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株及其構建方法、蛋白表達純化方法和蛋白應用。本發明的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA的大腸桿菌表達質粒pET30a ( + )，使得獲得的重組表達質粒在轉化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時能夠表達金針菇免疫調節蛋白。本發明的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的構建方法，是按照以下步驟進行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA ；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉錄PCR試劑盒進行RT-PCR，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達質粒pET30a ( + )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + )-FIP_fve連接產物轉入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株。本發明的獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白的方法，是按照以下步驟進行的將獲得的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養到OD6tltl為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導金針菇免疫調節蛋白表達，最后分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白；其中，所述的IPTG終濃度為O. Γ0. 5mM或O. 5 ImM。本發明所獲得的金針菇免疫調節蛋白在制備用于預防或治療過敏癥的藥物中的用途。本發明包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達的可溶性產物少(產量為5mg/L，KO JL etal.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進行變性復性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本發明的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的 tRNA 的高表達基因工程菌株 Transetta (DE3)。本發明的可溶性重組蛋白表達率為菌體總蛋白的40%以上，比以往的表達率僅為22%左右(張介馳等，2007)提高80%以上，產量為45mg/L以上，比2009年徐貴雪等用pET_28構建的表達載體生產的重組蛋白產量(30mg/L)提高了 50%以上。本發明使用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL)結合超聲波法(作用時間20min)使菌體破碎率達到98%以上，比單用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL，破碎率28%)和單用超聲波法(作用時間20min，破碎率40%)提高30%以上，并節約了成本；經圓二色譜測定表達蛋白二級結構，含15%的α-螺旋和38%的β折疊，比例接近天然蛋白，這是本發明的蛋白具有更好生物活性的結構基礎，更具有開發應用價值。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達可以得到與天然蛋白活性相當的重組蛋白。因為大腸桿菌發酵工藝簡單，具有抗生素抗性，發酵過程污染率極低。菌體離心后細胞破碎方法簡便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設計了 6個組氨酸純化標簽，使得純化過程簡單而快速。整個重組蛋白的生產過程只需要3 4天，適合用大型液體發酵設備進行規模化生產。本發明為其作為抗過敏藥物及免疫調節藥物或保健食品的應用提供了大規模生產與純化技術的具體工藝。本發明構建了該蛋白的原核表達載體，并且轉入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構成的二級結構，重組蛋白結構更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩定，實驗證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設計附加序列作為純化標簽，簡化了分離純化環節，更適于規模化發酵生產；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產業化開發奠定基礎。


圖I為重組pET30a(+)-FIP-fve表達載體酶切后的電泳圖；I為重組pET30a(+)-FIP-fve表達載體酶切后得到的pET30a(+)和目的片段圖(箭頭所指為目的片段)；2 為重組 pET30a(+)-FIP-fve 表達載體；M 為 DNA Marker DL2000 ；M I 為 DNA Markerλ -HINDUI ；圖2為能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株誘導后表達產物SDS-PAGE電泳分析圖(20%SDS-PAGE);其中，I 為 Marker 蛋白質 Mr 標樣 Protein Ruler I (Lot#E10408TransGenBiotect), 12kD(2. O μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L), 40kD(I O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ；2 為重組 pET30a (+) -FIP-fve 表達載體轉化Transetta(DE3)菌株未誘導電泳圖；3為pET30a_FIP-fve轉化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導表達I. 5h后的電泳圖；4為pET30a-FIP-fve轉化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導表達3. Oh后的電泳圖；5為pET30a-FIP_fve轉化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導表達4. 5h后的電泳圖；圖3為不同濃度的IPTG在溫度為21°C的條件下誘導表達重組載體pET30a(+ ) -FIP-fve可溶性蛋白的蛋白電泳圖；其中，M為蛋白Marker Protein RulerI (Lot#E10408 TransGenBiotect), 12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 O. 2mM 的 IPTG誘導蛋白表達后的條帶；2為O. 5mM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶；3為I. OmM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶；圖4為不同濃度的IPTG在溫度為28°C的條件下誘導表達重組載體pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白電泳圖；其中，M 為蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (I. 0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 0. 2mM 的 IPTG 誘導蛋白表達后的條帶，2為O. 5mM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶，3為I. OmM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶；圖5為不同濃度的IPTG在溫度為37°C的條件下誘導表達重組載體pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白電泳圖；其中，M 為蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (
I.0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 0. 2mM 的 IPTG 誘導蛋白表達后的條帶，2為0. 5mM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶，3為I. OmM的IPTG誘導蛋白表達后的條帶；圖6為重組金針菇免疫調節蛋白表達、菌體裂解方法比較及純化前后SDS-PAGE電泳結果圖；1為溶菌酶+超聲波裂解；2為未親合蛋白液；3為表達菌液；4為溶菌酶裂解；5為漂洗部分；6為前洗脫的目的蛋白；7為后洗脫的目的蛋白；MSProtein Marker ProteinRuler I(Lot#E10408 TransGen Biotect),12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. 0 μ g/5 μ L)，60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L)；圖7為重組金針菇免疫調節蛋白表達及柱層析純化前后SDS-PAGE電泳結果圖；其中，I為未未和蛋白；2為漂洗部分3為表達囷液裂解蛋白；4為洗脫目的蛋白；圖8為圓二色譜測定的重組蛋白的二級結構圖，其中，I為基線，2為計算值，3為測量值。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA的大腸桿菌表達質粒pET30a( + )，使得獲得的重組表達質粒在轉化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時能夠表達金針燕免疫調節蛋白。本實施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達的可溶性產物少(產量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進行變性復性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的 tRNA 的高表達基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達可以得到與天然蛋白活性相當的重組蛋白。因為大腸桿菌發酵工藝簡單，具有抗生素抗性，發酵過程污染率極低。菌體離心后細胞破碎方法簡便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設計了 6個組氨酸純化標簽，使得純化過程簡單而快速。整個重組蛋白的生產過程只需要3 4天，適合用大型液體發酵設備進行規模化生產。本實施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調節藥物或保健食品的應用提供了大規模生產與純化技術的具體工藝。本實施方式構建了該蛋白的原核表達載體，并且轉入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構成的二級結構，重組蛋白結構更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩定，實驗證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設計附加序列作為純化標簽，簡化了分離純化環節，更適于規模化發酵生產；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產業化開發奠定基礎。
具體實施方式
二 本實施方式的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的構建方法，是按照以下步驟進行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA ；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉錄PCR試劑盒進行RT-PCR，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達質粒pET30a ( + )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + )-FIP_fve連接產物轉入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株。本實施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達的可溶性產物少(產量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進行變性復性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的 tRNA 的高表達基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達可以得到與天然蛋白活性相當的重組蛋白。因為大腸桿菌發酵工藝簡單，具有抗生素抗性，發酵過程污染率極低。菌體離心后細胞破碎方法簡便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設計了 6個組氨酸純化標簽，使得純化過程簡單而快速。整個重組蛋白的生產過程只需要3 4天，適合用大型液體發酵設備進行規模化生產。本實施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調節藥物或保健食品的應用提供了大規模生產與純化技術的具體工藝。本實施方式構建了該蛋白的原核表達載體，并且轉入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構成的二級結構，重組蛋白結構更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩定，實驗證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設計附加序列作為純化標簽，簡化了分離純化環節，更適于規模化發酵生產；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產業化開發奠定基礎。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟三中所述的編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達質粒pET30a ( + )中操作步驟為將步驟一獲得的金針菇免疫調節蛋白編碼cDNA以及表達載體pET30a(+)采用BamH I和EcoR I進行雙酶切，酶切后純化回收金針菇免疫調節蛋白編碼cDNA與表達載體pET30a(+)，然后采用連接酶進行連接，得到重組載體pET30a ( + )-FIP-fve連接產物。其它與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白的方法，是按照以下步驟進行的按照具體實施方式
二的方法獲得的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養到0D_為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導金針菇免疫調節蛋白表達，最后分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白；其中，所述的IPTG 終濃度為 O. Γ0. 5mM 或 O. 5 ImM。本實施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達的可溶性產物少(產量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進行變性復性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的 tRNA 的高表達基因工程菌株 Transetta (DE3)。本實施方式的可溶性重組蛋白表達率為菌體總蛋白的40%以上，比以往的表達率僅為22%左右(張介馳等，2007)提高80%以上，產量為45mg/L以上，比2009年徐貴雪等用pET-28+構建的表達載體生產的重組蛋白產量(30mg/L)提高了 50%以上。本發明使用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL)結合超聲波法(作用時間20min)使菌體破碎率達到98%以上，比單用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL，破碎率28%)和單用超聲波法(作用時間20min，破碎率40%)提高30%以上，并節約了成本；經圓二色譜測定表達蛋白二級結構，含15%的α -螺旋和38%的β折疊，比例接近天然蛋白，這是本實施方式的蛋白具有更好生物活性的結構基礎，更具有開發應用價值。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達可以得到與天然蛋白活性相當的重組蛋白。因為大腸桿菌發酵工藝簡單，具有抗生素抗性，發酵過程污染率極低。菌體離心后細胞破碎方法簡便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設計了 6個組氨酸純化標簽，使得純化過程簡單而快速。整個重組蛋白的生產過程只需要3 4天，適合用大型液體發酵設備進行規模化生產。本實施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調節藥物或保健食品的應用提供了大規模生產與純化技術的具體工藝。本實施方式構建了該蛋白的原核表達載體，并且轉入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構成的二級結構，重組蛋白結構更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩定，實驗證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設計附加序列作為純化標簽，簡化了分離純化環節，更適于規CN 102925403 A
書
明
說
6/16 頁
模化發酵生產；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產業化開發奠定基礎。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是所述的金針菇免疫調節蛋白序列如序列表Seq ID No:2所不。其它與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
四或五不同的是所述的分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白的操作步驟包括一、取按照具體實施方式
二的方法獲得的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株，按體積比為1:1(Γ200的比例接種于LB液體培養基中，加入終濃度為O. OflmM的IPTG，然后在溫度為8°C 37°C，轉速為8(T280rpm/min的條件下誘導培養12 48h ；二、取步驟一誘導培養后的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株菌液，在轉速為100(Tl5000rpm/min的條件下，離心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后將收集的沉淀重懸于10^200倍重量的PBS緩沖液中，得菌懸液；三、向步驟二得到的菌懸液中加入終濃度為O. riOmg/mL的溶菌酶，在溫度為30 37°C條件下孵育5 30min，得菌液；四、將步驟三中得到的菌液置于冰浴中，在超聲功率為20W 200W，間隔時間f 30s的條件下，超聲處理l 50min ；五、將步驟四超聲處理的菌液在溫度為4°C，轉速為500(Tl5000rpm/min的條件下，離心I 30min,收集上清液采用Ni-His Band柱層析,然后采用Sephadex G25凝膠層析柱方法進行脫鹽，用O. 02M、pH為7. 8的PBS進行洗脫，即獲得純化的表達蛋白溶液，完成分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白。其它與具體實施方式
四或五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
四至六之一不同的是步驟二中所述的PBS緩沖液pH為8. O。其它與具體實施方式
四至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
四至七之一不同的是步驟五中所述的采用Ni-His · Band柱層析，所用的Wash緩沖液為含有濃度為50mM咪唑基的Wash緩沖液、所用的洗脫緩沖液成分為500mM的咪唑、O. 5M的NaCl，20mM的Tris-HCl ;其中，洗脫緩沖液PH為7. 9。其它與具體實施方式
四至七之一相同。
具體實施方式
九本實施方式所獲得的金針菇免疫調節蛋白在制備用于預防或治療過敏癥的藥物中的用途。本實施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達的可溶性產物少(產量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進行變性復性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的 tRNA 的高表達基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達可以得到與天然蛋白活性相當的重組蛋白。因為大腸桿菌發酵工藝簡單，具有抗生素抗性，發酵過程污染率極低。菌體離心后細胞破碎方法簡便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設計了 6個組氨酸純化標簽，使得純化過程簡單而快速。整個重組蛋白的生產過程只需要3 4天，適合用大型液體發酵設備進行規模化生產。本實施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調節藥物或保健食品的應用提供了大規模生產與純化技術的具體工藝。
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本實施方式構建了該蛋白的原核表達載體，并且轉入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構成的二級結構，重組蛋白結構更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩定，實驗證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設計附加序列作為純化標簽，簡化了分離純化環節，更適于規模化發酵生產；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產業化開發奠定基礎。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
九不同的是制備用于預防或治療過敏癥的藥物的方法，包括將具體實施方式
四得到的金針菇免疫調節蛋白與可藥用載體混合，即制得用于預防或治療過敏癥的凍干粉針藥物；其中，可藥用載體為甘露醇或右旋糖酐，添加量為39Γ6%。其它與具體實施方式
九相同。通過以下試驗驗證本發明的有益效果試驗I本試驗的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的構建及其蛋白表達純化一、能夠表達金針菇免疫調節蛋白基因的提取采用TaKaRa公司的RNAisoforPolysaccharide-rich Plant Tissue試劑盒提取白B品種(由黑龍江省科學院微生物研究所提供)的金針菇總RNA ；二、能夠表達金針菇免疫調節蛋白基因的PCR擴增以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉錄PCR試劑盒(購買自TaKaRa公司)進行RT-PCR，得擴增產物，將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit(購買自TaKaRa公司)進行純化回收，獲得了金針菇免疫調節蛋白基因；將金針菇免疫調節蛋白基因進行測序，序列提交GenBank獲得序列號為⑶388420. I，該序列與報道的FIP-fve基因的序列同源
100%(K0 JL et al.，1997)，重組蛋白His-FIP-fve的開放讀碼框為510bp(如序列表SeqID No 1所示)，其編碼170個氨基酸(如序列表Seq ID No 2所示)，分子量為18780kDa ；三、重組表達載體pET30a ( + ) -FIP-fve的構建a、表達載體pET30a ( + )的DNA提取取I. 5mL活化培養表達載體pET30a ( + )的菌液，離心收集菌體，懸浮于O. 35mL的STET裂解液中，加入25 μ L新配制的溶菌酶，振蕩混合3s，將反應管置于沸水浴40s，立即取出然后離心lOmin，用牙簽從管中取出沉淀，向上清液中加入40 μ L濃度為2. 5mol/L的醋酸鈉溶液和420 μ L的異丙醇，快速混合后，在_70°C溫度下靜置15min后，取出置于4°C，以12000r/min轉速離心lOmin，棄上清液，收集沉淀加入ImL質量百分含量為70%的乙醇，然后在4°C溫度下，以12000r/min轉速離心2min，收集沉淀進行干燥，將干燥后的沉淀溶于50 μ L的TE中，貯存于-20°C，待用；b > BamH I 和 EcoR I 雙酶切將步驟二得到的金針菇免疫調節蛋白基因，以及步驟a得到的表達載體pET30a(+)分別進行BamH I和EcoR I雙酶切；其中，金針菇免疫調節蛋白基因酶切反應條件先加入BamH I在30°C溫度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C溫度下，酶切I. 0h，然后將酶切的金針菇免疫調節蛋白基因在65°C水浴進行酶滅活lOmin，然后采用飽和酚試劑抽提，取上層液體，加入3倍體積預冷的(T4°C無水乙醇，在4°C溫度下放置Ih后，在轉速為12000r/min的條件下離心15min，收集沉淀，沉淀用質量百分含量為75%預冷乙醇洗滌一次，然后離心，再用滅無菌水溶解，得到酶切后的金針菇免疫調節蛋白基因，將其連接到同樣酶切并純化的pET30a( + )質粒(購買自 Amersham Pharmacia Biotech 公司)上，構建重組質粒 pET30a ( + )-FIP-fve。其中，pET30a ( + )質粒的酶切純化反應為將表達載體pET30a(+)先加入BamH I在30°C溫度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C，酶切I. Oh，向反應液中加入3倍體積的DB Buffer (購買自TaKaRa公司)均勻混合,轉移至Spin Column (購買自TaKaRa公司)中，在轉速為12000r/min的條件下，離心lmin，收集濾液，然后加入Spin Column中重復離心I次，棄濾液，收集沉淀；分別用500 μ L的Rinse A (購買自TaKaRa公司)和700 μ L的RinseB(購買自TaKaRa公司)清洗,然后在轉速為12000r/min的條件下離心30s,棄濾液，收集沉淀；在3 111 Column膜的中央處加入25 μ L溫度為60°C的滅菌蒸餾水，室溫靜置lmin，然后在轉速為12000r/min的條件下離心lmin，洗脫酶切后的pET30a ( + )質粒。C、連接將步驟b酶切后的pET30a ( + )質粒和金針菇免疫調節蛋白基因，按目的片段載體=5:1摩爾比混合，在T4DNA連接酶的作用下，在16°C連接反應24h，得到重組載體pET30a(+ )-FIP-fve連接產物；四、金針菇免疫調節蛋白基因工程重組菌株的構建通過熱激轉化法將pET30a_FIP-fve 轉入 Transetta (DE3)大腸桿菌(購買自 TransGen Biotech 公司，商品編號⑶801)中，取0. OOflmL的轉化培養物涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C溫箱中培養過夜，同時取另外兩管不含重組子的培養物分別涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板和不含卡那霉素的LB瓊脂平板上作對照，次日觀察各平板中菌落的生長情況，若對照平板中含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板未長菌落，不含卡那霉素的LB瓊脂平板上長有菌落，則取涂轉化菌的含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板長出的單菌落接種于5mL的LB培養基中，置于37°C空氣浴搖床振蕩培養過夜，即得金針菇免疫調節蛋白基因工程重組菌株；五、陽性重組子的篩選、鑒定及表達鑒定d、重組載體 pET30a ( + ) -FIP-fve 的 PCR 鑒定取IyL步驟四得到的金針菇免疫調節蛋白基因工程重組菌株，用滅菌去離子水稀釋500 1000倍后，取I μ L做模板進行PCR擴增，PCR反應體系如下
權利要求
1.能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株，其特征在于能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA的大腸桿菌表達質粒pET30a( + )，使得獲得的重組表達質粒在轉化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時能夠表達金針燕免疫調節蛋白。
2.構建如權利要求I所述的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的方法，其特征在于所述的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的構建方法是按照以下步驟進行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉錄PCR試劑盒進行RT-PCR，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達質粒pET30a(+ )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + ) -FIP-fve連接產物轉入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株。
3.根據權利要求2所述的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的構建方法，其特征在于步驟三中所述的編碼金針菇免疫調節蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達質粒pET30a ( + )中操作步驟為將步驟一獲得的金針菇免疫調節蛋白編碼cDNA以及表達載體pET30a(+)采用BamH I和EcoR I進行雙酶切，酶切后純化回收金針菇免疫調節蛋白編碼cDNA與表達載體pET30a(+)，然后采用連接酶進行連接，得到重組載體pET30a( + )-FIP_fVe連接產物。
4.獲得如權利要求I所述的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的方法是按照以下步驟進行的按照權利要求2的方法獲得的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養到OD6tltl為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導金針菇免疫調節蛋白表達，最后分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白；其中，所述的IPTG終濃度為O. Γ0. 5mM或O.5 ImM。
5.根據權利要求4所述的獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于所述的金針菇免疫調節蛋白序列如序列表Seq ID No :2所/Jn ο
6.根據權利要求4獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于所述的分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白的操作步驟包括一、取按照權利要求2的方法獲得的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株，按體積比為1:10^200的比例接種于LB液體培養基中，加入終濃度為O. OflmM的IPTG，然后在溫度為80C 37°C，轉速為8(T280rpm/min的條件下誘導培養12 48h ；二、取步驟一誘導培養后的金針菇免疫調節蛋白基因工程菌株菌液，在轉速為100(Tl5000rpm/min的條件下，離心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后將收集的沉淀重懸于10^200倍重量的PBS緩沖液中，得菌懸液；三、向步驟二得到的菌懸液中加入終濃度為O.riOmg/mL的溶菌酶，在溫度為3(T37°C條件下孵育5 30min，得菌液；2四、將步驟三中得到的菌液置于冰浴中，在超聲功率為20W 200W，間隔時間l 30s的條件下，超聲處理l 50min ；五、將步驟四超聲處理的菌液在溫度為4°C，轉速為500(Tl5000rpm/min的條件下，離心I 30min,收集上清液采用Ni-His · Band柱層析,然后采用Sephadex G25凝膠層析柱方法進行脫鹽，用O. 02M、pH為7. 8的PBS進行洗脫，即獲得純化的表達蛋白溶液，完成分離和純化表達的金針菇免疫調節蛋白。
7.根據權利要求6所述的獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于步驟二中所述的PBS緩沖液pH為8. O。
8.根據權利要求6所述的獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于步驟五中所述的采用Ni-His Band柱層析,所用的Wash緩沖液為含有濃度為50mM咪唑基的Wash緩沖液、所用的洗脫緩沖液成分為500mM的咪唑、O. 5M的NaCl, 20mM的Tris-HCl ;其中，洗脫緩沖液pH為7. 9。
9.如權利要求4所述的獲得能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株的金針菇免疫調節蛋白的方法，其特征在于所獲得的金針菇免疫調節蛋白在制備用于預防或治療過敏癥的藥物中的用途。
10.根據權利要求9所述的獲得的能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株金針菇免疫調節蛋白在制備用于預防或治療過敏癥的藥物中的用途，其特征在于制備用于預防或治療過敏癥的藥物的方法，包括將權利要求4得到的金針菇免疫調節蛋白與可藥用載體混合，即制得用于預防或治療過敏癥的凍干粉針藥物；其中，可藥用載體為甘露醇或右旋糖酐，添加量為3%飛％。
全文摘要
一種能夠表達金針菇免疫調節蛋白的重組菌株及其構建方法、蛋白表達純化方法和蛋白應用，它涉及一種重組菌株的構建、表達純化及其應用。本發明要解決現有金針菇免疫調節蛋白工程菌株表達率低，表達產物多為不溶性的包涵體，結構不確定以及菌體破碎、純化工藝復雜不適合大規模生產應用的問題。本發明將金針菇免疫調節蛋白基因，以Transetta(DE3)作為宿主菌，構建重組菌株；再用IPTG誘導表達，通過溶菌酶法結合超聲法處理后采用Ni-His·Band柱層析，Sephadex G25凝膠層析柱方法脫鹽，即完成重組菌株的構建及表達純化。其用于制備預防或治療過敏癥的藥物。其純化過程簡單而快速，適于規模化發酵生產。
文檔編號C12N1/21GK102925403SQ201210475139
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者孔祥輝, 張介馳, 張丕奇, 戴肖東, 韓增華, 馬慶芳, 劉佳寧, 黨阿麗 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所