專利名稱：發酵法生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特別是涉及一種發酵法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
背景技術：
2-酮基-D-葡萄糖酸是一種葡萄糖氧化產物，是一種目前大規模生產的有機酸，其可以用作食品添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑等。目前2-酮基-D-葡萄糖酸主要用于合成D-異抗壞血酸。D-異抗壞血酸與L-抗壞血酸(維生素C)性質接近，具有抗氧化作用和抗壞血酸作用，廣泛用于食品添加劑，替代L-抗壞血酸。2-酮基-D-葡萄糖酸的生產方法主要有3類，包括酶法合成、化學合成和發酵法生產。發酵法生產2-酮基-D-葡萄糖酸主要利用假單胞菌屬的細菌、粘質沙雷氏菌、產酮產堿菌等細菌為生產菌株，利用葡萄糖為原料發酵生產。其中，工業上主要選用熒光假單胞菌為生產菌株(魏轉，余泗蓮，孫文敬，周強，李中兵.2-酮基-D-葡萄糖酸發酵生產研究進展，食品科學，2008，08 :636-639)。腸桿菌科的很多種細菌可以氧化葡萄糖生產葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸，其中包括克雷伯氏菌屬的一些菌株，有報道克雷伯氏肺炎桿菌NCTC418在部分營養成分限制條件下培養可以合成葡萄糖和2-酮基-D-葡萄糖酸(Ed T. Buurman, Josc L. Boiardi, M.Joost Teixeira de Mattosj Oense M. Neijssel, The role of magnesium and calciumions in the glucose dehydrogenase activity of Klebsiella pneumoniae NCTC418，Arch Microbiol(1990) 153 :502_505)。利用假單胞菌屬的細菌、粘質沙雷氏菌和產酮產堿菌等細菌發酵培養溫度一般在28°C，使得生產中用于降溫的能耗較高；同時，假單胞菌屬的細菌容易感染噬菌體，影響生產。因此，需要開發更為經濟性的生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種發酵法生產2-酮基D-葡萄糖酸的方法。通過該方法，能夠經濟高效地生產2-酮基-D-葡萄糖酸。為解決上述技術問題，本發明的發酵法生產2-酮基D-葡萄糖酸的方法，是利用2，3 丁二醇合成途徑缺失的雷伯氏肺炎桿菌作為生產菌株，在好氧發酵條件下，控制發酵液處于酸性條件，以葡萄糖為原料生產2-酮基-D-葡萄糖酸。所述2，3- 丁二醇合成途徑缺失的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法，是通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3- 丁二醇合成途徑中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，實現克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3-丁二醇能力的消除。其中，乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，是通過基因突變進行失活，優選為通過基因同源重組進行失活。所述控制發酵液處于酸性條件中，可通過加入堿液或碳酸鹽進行調節，使其保持一定的酸性；其中，堿液包括氫氧化鈉、氫氧化鉀和氨水，碳酸鹽包括碳酸鈣、碳酸鈉和碳酸氫鈉。 所述酸性條件中，其pH值為6. 5 3，優選pH值為5. 5 4. 5。所述好氧發酵條件中，發酵溫度為20 45攝氏度，優選35 40攝氏度。本發明的發酵法生產2-酮基-D-葡萄糖酸，具有較高的轉化率，發酵過程控制容易，發酵過程降溫能耗較低。
具體實施例方式以下實施例中涉及的構建的2，3-丁二醇合成途徑消除的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCCI. 6366-budA 其具體的構建方法如下I、利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乙酰乳酸脫羧酶基因(budA)。根據克雷伯氏肺炎桿菌MGH78578 (Genbank: CP000647)基因組信息，設計乙酰乳酸脫羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s :GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO. I 所示)，下游引物 budA-a :CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ ID NO. 2 所示)。通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366 (CGMCCI. 6366菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，具有氨芐青霉素抗性)基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得乙酰乳酸脫羧酶基因片段，通過TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)連接到pMD_18Tsimple質粒上,命名為pMD18T_budA質粒,序列測定結果如下budA基因相鄰上游部分序列為GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA (SEQ IDNO. 3所示)。budA基因閱讀框為AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGCCGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCCGGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATTGACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATAATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT (SEQ ID NO. 4 所示)。budA基因相鄰下游部分序列為ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATCCCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCC
4ACGAAGCTAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTTCCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCCGATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG (SEQ ID NO. 5 所示)。2、利用步驟I克隆到的基因序列，制備兩側連有同源臂中間連接抗性核的DNA片段。 本步驟中的操作，采用在大腸桿中利用Red重組酶催化，具有同源臂連接抗性核的DNA片段與pMD18T-budA質粒進行同源重組，獲得pMD18T_budA質粒上失活的budA基因，利用該質粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側連有與budA基因上下游序列同源的序列，中間連接抗性核。本步驟操作原理可參見(Weiet. al. Red recombinase assisted genereplacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology2012),具體步驟如下a. pMD18T-budA質粒熱擊轉化到含有pIJ790質粒的大腸桿菌DH5 a -pIJ790中，命名為 DH5 a -pMD18T-budA。制備DH5 a -pMD18_budA感受態細胞，在菌體培養I個小時后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，誘導PIJ790質粒中Red重組酶的表達。b.設計引物budA_s2和budA_a2，序列分別為GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ IDNO. 6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ IDNO. 7所示)。弓丨物budA-s2 的 “GCCCTGCTGAGCGGGGITTACGAAGGCAGCACCACCATC” 序列與 budA 基因序列同源，引物 budA-a2 的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列與 budA基因相應序列同源。利用引物budA_s2和budA_a2，以質粒pIJ778為模板擴增出長約1491bp的DNA片段A。該片段兩段分別具有與budA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質粒的鏈霉素抗性基因aadA。c.利用DNA片段A轉化感受態DH5a-pMD18T-budA感受態細胞。利用電擊轉化方法，轉化電壓為2000V，選擇鏈霉素抗性的菌株，鏈霉素用量為50mg/L。DNA片段A兩側的同源序列與質粒pMD18T_budA上的budA同源部分發生重組，獲得了 pMD18T-A 質粒。d.利用引物 budA-s (SEQ ID NO. I 所示)和 budA-a (SEQ ID NO. 2 所示)，以PMD18T-A質粒為模板進行PCR擴增，獲得3114bp的DNA片段B。DNA片段B兩端分別具有1131bp和571bp的budA基因和相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于進行CGMCC1. 6366染色體上budA基因重組的線性DNA片段。3、利用轉化或結合方法將制備的DNA片段B轉入到克雷伯氏肺炎桿菌中，利用同源重組與染色體上的乙酰乳酸脫羧酶基因進行重組，篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株，具體步驟如下
a.將 pDK6-red 質粒轉化到 CGMCC1. 6366 中，獲得 CGMCC1. 6366-pDK6_red 菌株，線性DNA片段B電擊轉化CGMCC1. 6366-pDK6-red感受態細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。b.重組菌的驗證，設計驗證引物 Yanzheng778z AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG(SEQ ID NO. 8所示)，其序列對應鏈霉素抗性基因aadA中間的一段序列。利用引物budA-s (SEQ ID NO. I所示)和Yanzheng778z,以長出的菌株總DNA為模板進行PCR擴增，產物DNA片段為1889bp，而以出發菌株CGMCC1. 6366總DNA為模板進行PCR無特異性條帶，表明獲得的重組菌正確，命名為CGMCC1. 6366-budA_。該菌株的乙酰乳酸脫羧酶基因通過同源重組而失活。實施例I利用上述構建的2，3- 丁二醇合成途徑消除的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCCI. 6366budA_發酵葡萄糖生產2-酮基-D-葡萄糖酸，其步驟如下I)配制培養基葡萄糖50g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L,經自來水混合配制后，分裝到250mL錐形瓶中，裝液量50mL，每瓶添加碳酸鈣O. 5g，并滅菌。所用試劑均為國產商業產品。2)接種微生物并進行好氧培養每瓶培養基中接入克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366_budA_ —接種環，37°C搖床好氧培養，轉速為200轉每分鐘，培養發酵48小時，利用添加的碳酸鈣控制發酵過程pH，發酵過程PH逐漸降低到4. 5。將培養好的發酵液用高效液相色譜儀，利用HPX-87H色譜柱，視差檢測器對發酵液組分進行檢測，檢測結果為2_酮基-D-葡萄糖酸41. 2g/L，2，3- 丁二醇O. 51g/L，乳酸
O.5g/L，琥珀酸O. 3g/L，乙酸I. 5g/L。其中，底物葡萄糖向產物2-酮基-D-葡萄糖酸的轉化率為82. 4%ο實施例2利用上述構建的2，3- 丁二醇合成途徑消除的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCCI. 6366-budA_發酵葡萄糖生產2-酮基-D-葡萄糖酸，其步驟如下I)配制種子培養基葡萄糖30g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L,經自來水混合配制后，分裝到250mL錐形瓶中，裝液量50mL，并滅菌。2)配制發酵培養基葡萄糖50g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L,經自來水混合配制后，將4L發酵培養基裝入容量為5L的發酵罐內，滅菌。3)種子培養每瓶種子培養基中接入克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366_budA_ —接種環，37°C搖床好氧培養，轉速為200轉每分鐘，培養12小時。4)發酵培養將IOOml種子培養物接入發酵罐中，37°C培養，攪拌槳轉速為400轉每分鐘，通風量為4升每分鐘，用20% (質量濃度)的氫氧化鈉溶液控制發酵過程pH為4. 8 5. 2，培養發酵24小時。
將培養好的發酵液用高效液相色譜儀，利用HPX-87H色譜柱視差檢測器對發酵液組分進行檢測，檢測結果為2_酮基-D-葡萄糖酸52. 5g/L。其中，底物葡萄糖向產物2-酮基D-葡萄糖酸的轉化率為105%。
權利要求
1.一種發酵法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于所述方法是利用2，3-丁二醇合成途徑缺失的雷伯氏肺炎桿菌作為生產菌株，在好氧發酵條件下，控制發酵液處于酸性條件，以葡萄糖為原料生產2-酮基-D-葡萄糖酸。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述2，3-丁二醇合成途徑缺失的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法，是通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3- 丁二醇合成途徑中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，實現克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3-丁二醇能力的消除。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，是通過基因突變進行失活。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，是通過基因同源重組進行失活。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述控制發酵液處于酸性條件中，是通過加入堿液或碳酸鹽進行調節，使其保持酸性；其中，堿液包括氫氧化鈉、氫氧化鉀和氨水；碳酸鹽包括碳酸鈣、碳酸鈉和碳酸氫鈉。
6.如權利要求
7.如權利要求
8.如權利要求攝氏度。
9.如權利要求
全文摘要
本發明公開了一種發酵法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，是利用2,3-丁二醇合成途徑缺失的雷伯氏肺炎桿菌作為生產菌株，在好氧發酵條件下，控制發酵液處于酸性條件，以葡萄糖為原料生產2-酮基-D-葡萄糖酸。本發明具有較高的轉化率，發酵過程控制容易，發酵過程降溫能耗較低。
文檔編號C12P7/58GK102925499SQ20121047692
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者郝健, 魏東, 柳鵬福, 史吉平, 姜標 申請人:上海中科高等研究院