專利名稱：一種pcr檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法。
背景技術(shù)：
森林蔥蝸牛nemoralis (Linnaeus)是國(guó)際植物檢疫中倍受關(guān)注的危險(xiǎn)性有害生物，其貝殼與同屬的花園蔥蝸牛CfeAaea hortensis Miiller等近似種極為相似，往往難以區(qū)分，且只有資深的陸生貝類學(xué)分類專家才能鑒別，卵粒和幼螺的鑒定則更為困難。由于歷史的原因，目前國(guó)境口岸的植物檢疫員多為植物保護(hù)專業(yè)，對(duì)陸生軟體動(dòng)物的分類知之甚少，這種局面給我國(guó)的實(shí)際檢疫工作造成了被動(dòng)，也是世界各國(guó)檢驗(yàn)檢疫部門共同面臨的技術(shù)難題。最近二十多年來(lái)，分子系統(tǒng)學(xué)飛速發(fā)展，即由基因序列的比較可以厘清 物種的分類學(xué)與系統(tǒng)學(xué)地位。因此可以將形態(tài)和分子特征結(jié)合起來(lái)，對(duì)森林蔥蝸牛及其近似種的分類學(xué)進(jìn)行更為深入而詳盡的研究，為森林蔥蝸牛的快速準(zhǔn)確鑒定提供新的技術(shù)手段。而PCR技術(shù)在國(guó)境口岸檢疫部門已經(jīng)相當(dāng)普及，如果能設(shè)計(jì)出特異性引物用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行初篩或鑒定，這個(gè)難題就迎刃而解。本發(fā)明建立了一種PCR方法檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的技術(shù)，以適應(yīng)當(dāng)前國(guó)境口岸檢疫工作的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)所存在的不足開(kāi)展研究，旨在提供一種準(zhǔn)確性好、靈敏度高、成本低廉的檢測(cè)方法，應(yīng)用于森林蔥蝸牛的快速檢測(cè)鑒定。本發(fā)明提供了一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法，所述方法是應(yīng)用特異性引物對(duì)森林蔥蝸牛的分子特征進(jìn)行識(shí)別，所述引物為
上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系總體積為25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補(bǔ)足。所述PCR 反應(yīng)的程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，結(jié)束反應(yīng)。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛。本發(fā)明為植物檢疫中對(duì)危險(xiǎn)性有害生物森林蔥蝸牛的檢測(cè)鑒定提供了新的技術(shù)手段，對(duì)于防止森林蔥蝸牛的傳播和擴(kuò)散具有重要意義。本發(fā)明所提供的一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法具有以下有益效果
I、結(jié)果可靠本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的一種鑒定森林蔥蝸牛的特異性檢測(cè)引物，僅針對(duì)森林蔥蝸牛進(jìn)行檢測(cè)，已經(jīng)對(duì)花園蔥蝸牛hortensis ;散大蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛故;斯文豪大蝸牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蝸牛{Acusta) ravida rarit/a ;地中海白蝸rirgaia進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證。2、特異性強(qiáng)所采用的引物是針對(duì)森林蔥蝸牛的CO I基因序列設(shè)計(jì)出的特異性引物，特異性高。3、靈敏度高對(duì)森林蔥蝸牛的檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)到IOfg/ μ L。4、實(shí)用性好當(dāng)傳統(tǒng)分類學(xué)方法難以鑒定森林蔥蝸牛時(shí)，本發(fā)明方法用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行彌補(bǔ)，從而得到快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的PCR方法。因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足對(duì)森林蔥蝸牛進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要。


圖I為森林蔥蝸牛PCR引物特異性試驗(yàn)結(jié)果。其中M為IOObp DNA ladderMarker ;泳道1為森林蔥蝸牛Cepaea nemoralis ;泳道2為花園蔥蝸牛Cepaea hortensis ； 泳道3為散大蝸牛aspersa ;泳道4為蓋罩大蝸牛pomatia ;泳道5為斯文豪大蝸牛Afe1SioAeJijr swinhoei ;泳道6 為灰尖巴蝸牛{Acusta) ravida ravida ；泳道7為地中海白蝸牛virgata。圖2為森林蔥蝸牛PCR檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。其中M為IOObp DNA ladderMarker ;泳道 I 為 IOng/ μ L ;泳道 2 為 Ing/ μ L ;泳道 3 為 IOOpg/ μ L ;泳道 4 為 IOpg/ μ L ；泳道5為Ipg/ μ L ;泳道6為IOOfg/ μ L ;泳道7為IOfg/ μ L。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I:森林蔥蝸牛PCR弓I物特異性試驗(yàn)
1、材料的準(zhǔn)備
供試蝸牛如下森林蔥蝸牛CfeAaea;花園蔥蝸牛Cepaea hortonsis
蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛pomatia ;斯文豪大蝸牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蝸牛 JSraafJrAaezja {Acusta) raFit/a raFit/a ;地中海白蝸牛Virgata0以上供試蝸牛系全國(guó)口岸檢疫中截獲,經(jīng)質(zhì)檢總局國(guó)家軟體動(dòng)物檢疫鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)后，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR方法的建立
2.I、引物的設(shè)計(jì)合成基于森林蔥蝸牛CO I (線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I)基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5和Oligo 6設(shè)計(jì)和分析引物,經(jīng)NCBIBlast檢驗(yàn)其特異性后，交由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物如下
上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。擴(kuò)增片段大小為580bp。2. 2、DNA 提取
2.2. I、異硫酸氰胍法將準(zhǔn)備好的陽(yáng)性樣品(森林蔥蝸牛Cepaea nemoralis)和陰性對(duì)照樣品(花園蔥蝸牛Cepaea hortensis ;散大蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛pomatia ;斯文豪大蝸牛Afe1SioAeJix swinhoei ;灰尖巴蝸牛(Acusta) ravidaravida ;地中海白蝸牛剪碎后分置于研缽內(nèi)，加液氮研磨成粉末取5011^，再加入20(^1^ TE，混勻；加入400 μ L裂解液，渦旋混勻，放置IOmin ;然后加入300 μ LTris-飽和酹和300 μ L氯仿:異戍醇(24:1),劇烈震蕩15s, 13 000r/min離心IOmin ;取上清，加等體積的氯仿異戍醇(24:1),劇烈震蕩15s, 13 000r/min離心IOmin ;取上清,加等體積的氯仿，劇烈震蕩15s, 13 000r/min, IOmin ;取上清,力口 O. 8倍體積的異丙醇，12 OOOr/min, IOmin,棄上清；取沉淀,加入70%的的無(wú)水乙醇ImL,離心13 000r/min,棄上清,后于真空干燥儀中干燥2min，再加入100 μ L滅菌ddH20溶解。用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA的濃度，最后用TE溶液將DNA稀釋至IOOng/ μ L，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2、試劑盒提取法TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取，按使用說(shuō)明書操作提取DNA。用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA的濃度，最后用TE溶液將DNA稀釋至IOOng/μ L,置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.3、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中2XTaq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補(bǔ)足。混勻后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。
2. 4、PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，結(jié)束反應(yīng)。2. 5,PCR產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定取PCR產(chǎn)物10 μ L在I. 5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40min，用凝膠成像儀觀察。如果觀察到在580bp的位置出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明所檢測(cè)的蝸牛樣品為森林蔥蝸牛。檢測(cè)結(jié)果表明只有森林蔥蝸牛樣品在580bp的位置擴(kuò)增出條帶，其他樣品都沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明此引物具有很強(qiáng)的特異性。
實(shí)施例2 :森林蔥蝸牛PCR檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)
采用10倍濃度系列稀釋法將實(shí)施例I中提取的森林蔥蝸牛DNA原液(IOOng/μ L)稀釋成 IOng/ μ L, lng/ μ L, 100 pg/ μ L, 10 pg/ μ L, I pg/ μ L, 100 fg/ μ L和 10 fg/ μ L共7個(gè)不同濃度梯度。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補(bǔ)足。混勻后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定取PCR產(chǎn)物10 μ L在I. 5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40min,用凝膠成像儀觀察。如果觀察到在580bp的位置出現(xiàn)條帶,則說(shuō)明該濃度可以被檢出。結(jié)果(圖2)顯示，在DNA濃度為IOfg/μ L時(shí)仍有微弱的條帶，表明此方法具有較高的靈敏度，可達(dá)到IOfg/μ L。
權(quán)利要求
1.一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于所述方法是應(yīng)用特異性引物對(duì)森林蔥蝸牛的分子特征進(jìn)行識(shí)別；所述引物為 上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，， 下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系總體積為25yL，其中2XTaq PCRMasterMix混合液12. 5 μ L,上、下游引物各O. 5 μ L,DNA模板2μ L,余下用滅菌ddH20補(bǔ)足。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin,結(jié)束反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種PCR檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛的方法，所述方法是應(yīng)用特異性引物對(duì)森林蔥蝸牛的分子特征進(jìn)行識(shí)別；其PCR反應(yīng)的上游引物為CN-(P1)5’-ACCTCCTTCCTTTCTACT-3’，下游引物為CN-(P2)5’-GTCAACATCTATCCCAAC-3’。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，余下用滅菌ddH2O補(bǔ)足；PCR反應(yīng)程序?yàn)?℃預(yù)變性5min；95℃50s，52℃30s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)。本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒定森林蔥蝸牛。本發(fā)明為植物檢疫中對(duì)危險(xiǎn)性有害生物森林蔥蝸牛的檢測(cè)鑒定提供了新的技術(shù)手段，對(duì)于防止森林蔥蝸牛的傳播和擴(kuò)散具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102952885SQ201210481179
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者周衛(wèi)川, 肖瓊, 邵碧英, 林陽(yáng)武 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心