專利名稱：一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法
技術領域：
本發明屬于細胞培養技術領域，尤其涉及一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法。
背景技術：
截至目前國內外尚無人建立海洋雙殼類細胞的體外培養體系，將范圍擴展至軟體動物門類，目前僅有一個細胞系成功建立，來自一種淡水蝸牛。細胞的取材體外培養的細胞多取材于動物胚胎、成年動物組織、人體手術活體材 料，幼蟲細胞是兼具胚胎細胞和幼蟲期特有細胞性質的高分裂能力的細胞，是一類具有體外培養前景的細胞來源。奸夷扇貝擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻Primary cell culturefromembryos of the Japanese seallop Mizuchopecten yessoensis (Bivalvia)(199ICytotechnology)貽貝面盤幼蟲細胞的體外培養。(備注面盤幼蟲是擔輪幼蟲下一個發育階段。)參考文獻！Isolation and partial characterization of myogenicceIlsfrom mussellarvae in vitro (2000Tissue Cell.)紫貽貝擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻Comparative CharacteristicofMytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo. (2003Journalof ExperimentalZoology.)油黑菜蛤擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻=Muscle andneuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilustrossulus(Mollusca Bivalvia) (2010Cell Tissue Research)幼蟲細胞的解離方式上述幼蟲細胞均采用無鈣水浸泡后再經O. 25%或O. 125%膠原酶解離的方式獲得單個的細胞。幼蟲細胞的除菌方法蝦夷扇貝，紫外線消毒海水并添加500U/ml青霉素和40 μ g/ml慶大霉素，培養基中添加40mg/l慶大霉素；油黑菜蛤，Percoll密度梯度離心法。細胞傳代方式目前尚無關于幼蟲細胞的傳代方法的報道，傳代培養的核心工作有兩方面，一是分割培養物，二是再次接種。把貼壁依賴型細胞從培養基質上解離下來的方法主要有1).胰蛋白酶溶液消化；2).對于貼壁不牢的細胞可采用機械的振蕩法。幼蟲培養基的優化奸夷扇貝幼蟲細胞培養基L15基礎培養基；添加如下鹽離子使滲透壓達到1100毫滲透摩爾濃度NaCl(18. 05克/升)，KCI (O. 29克/升)，CaCl2 · 2H20 (I. 205 克 / 升)，MgCl2 · 6H20 (5. 481 克 / 升)，MgSO4 · 7H20 (4. 28 克 / 升)。另添加如下成分牛磺酸(25暈克/升)，葡萄糖(50暈克/升)，谷氨酰胺(100暈克/升)，胎牛血清(2%體積比)，慶大霉素(40毫克/升)。擔油黑菜蛤幼蟲細胞培養基L_15基礎培養基；胎牛血清(2%體積比)，胰島素(50暈克/升)，維生素E (I. 75暈克/升)。
現有技術的缺點是無法實現貝類細胞的傳代培養。

發明內容
本發明提供了一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，旨在解決現有技術無法實現貝類細胞的傳代培養的問題。本發明的目的在于提供一種柿孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，該培養方法包括以下步驟 將單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23°C的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。進一步，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。進一步，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基由L15基礎培養基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素構成。進一步，步驟五，當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養的實現方法為當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，用移液管輕輕吹打或用細胞刮刀刮取獲得解離的單個細胞，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細胞培養瓶中完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。進一步，體外培養的細胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔輪幼蟲、D型幼蟲的細胞，同時該培養方法也可應用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細胞的培養中。進一步，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞時，在4°C下培養1-2天，原代培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞可存活且可抑制細菌污染，再轉到17-25°C培養箱中，細胞也可實現穩定傳代培養。進一步，在櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞培養早期，使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液，青霉素濃度為2500單位/毫升至25000單位/毫升，鏈霉素濃度為2500微克/暈升至25000微克/暈升鏈霉素。(與前一段重復)進一步，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。本發明提供的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，將櫛孔扇貝擔輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣消毒海水滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔輪幼蟲30分鐘以上，采用機械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞；將得到的單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23°C的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養，本發明建立了一種穩定的海洋無脊椎動物細胞體外培養的方法，能夠實現細胞的體外增殖和傳代培養，是首個海洋貝類的連續細胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細胞建系具有重要的指導意義。


圖I是本發明實施例提供的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法的實現流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。圖I示出了本發明實施例提供的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法的實現流程。該培養方法包括以下步驟步驟S101，將櫛孔扇貝擔輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；步驟S102，使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔輪幼蟲30分鐘以上，采用機械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞；步驟S103，將步驟S102得到的單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23°C的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；步驟S104，根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；步驟S105，當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。在本發明實施例中，在步驟S102中，櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣海水等滲緩沖液為含有2500單位/毫升青霉素、2500微克/毫升鏈霉素的高壓滅菌過濾海水的高滲透壓磷酸鹽緩沖溶液。在本發明實施例中，在步驟S102中，機械解離法的實現方法為手動搖晃含有櫛孔扇貝擔輪幼蟲的容器，并用移液管反復吹打含有櫛孔扇貝擔輪幼蟲的液體I分鐘以上，以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘后，收集得到解離的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞。在本發明實施例中，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。在本發明實施例中，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基由L15基礎培養基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/暈升鏈霉素構成。在本發明實施例中，步驟S105，當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養的實現方法為當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，用移液管輕 輕吹打或用細胞刮刀刮取獲得解離的單個細胞，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細胞培養瓶中完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。在本發明實施例中，體外培養的細胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔輪幼蟲、D型幼蟲的細胞，同時該培養方法也可應用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細胞的培養中。在本發明實施例中，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞時，在4°C下培養1-2天，原代培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞可存活且可抑制細菌污染，再轉到17_25°C培養箱中，細胞也可實現穩定傳代培養。在本發明實施例中，在櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞培養早期，使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液，青霉素濃度為2500單位/毫升至25000單位/毫升，鏈霉素濃度為2500微克/毫升至25000微克/毫升鏈霉素。在本發明實施例中，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。本發明的技術方案首先將櫛孔扇貝擔輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；配制櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣海水等滲緩沖液，配方是含有2500單位/毫升青霉素、2500微克/毫升鏈霉素的高壓滅菌過濾海水的高滲透壓磷酸鹽緩沖溶液；使用上述櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔輪幼蟲30分鐘以上，僅僅采用機械解離法即手動搖晃含有櫛孔扇貝擔輪幼蟲的容器并用移液管反復吹打含有櫛孔扇貝擔輪幼蟲的液體I分鐘以上，以1000轉/分鐘的速度離心5分鐘后收集得到解離的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞，均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液(添加2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素)的直徑為35毫米的細胞培養皿中，再置于20-23°C的生化培養箱中進行培養，16-24小時后得到貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞。根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，以維持櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞正常生長。當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，將其挑取出來實現早期傳代。當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，僅使用機械傳代法即用移液管輕輕吹打或用細胞刮刀刮取得解離的單個細胞，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細胞培養瓶中完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。所述的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基，其中含有L15基礎培養基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素。所述的機械解離法為手動劇烈晃動盛有櫛孔扇貝擔輪幼蟲個體的容器，以獲得分散的單個細胞的方法。所述的機械傳代法為通過移液管的吹打或細胞刮刀使體外培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞無損傷地從培養基質上脫離的方法。櫛孔扇貝擔輪幼蟲專用細胞培養基中添加維持細胞代謝需求的少量營養因子，SP實現櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的良好生長狀態，隨著細胞的分裂能夠實現細胞的穩定傳代培養，該方法操作簡單且成本低廉。
采用櫛孔扇貝擔輪幼蟲專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡與機械法結合的方式不經任何酶類的消化實現對細胞的完全解離，該方法對櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的損傷小，成本低效率高，具有可重復性。細胞取材取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔輪幼蟲、D型幼蟲的細胞均可在體外實現穩定培養。理論上，該培養方法是可以應用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細胞的培養中。細胞培養溫度在4°C下培養1-2天，原代培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞可存活且可抑制細菌污染。隨后再轉到17_25°C培養箱中，細胞也可實現穩定傳代培養。抗生素的使用在細胞培養早期使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液，其濃度在2500單位/暈升青霉素、2500微克/暈升鏈霉素至25000單位/暈升青霉素、25000微克/毫升鏈霉素均可抑制污染且得到穩定傳代的細胞系。培養基添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20% ;扇貝血清1% -10% ;青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。機械法方法進行細胞的傳代培養由于細胞貼壁能力較低，除了用細胞刮刀和移液管吹打法，一切可以將細胞機械搖晃下的辦法均可行。本發明實施例提供的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，將櫛孔扇貝擔輪幼蟲用正壓濾器過濾的無菌海水在500目篩絹上流水沖洗半小時以上，去除表面的微生物；使用櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡櫛孔扇貝擔輪幼蟲30分鐘以上，采用機械解離法解離得到分散的單個的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞；將得到的單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23°C的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養，本發明建立了一種穩定的海洋無脊椎動物細胞體外培養的方法，能夠實現細胞的體外增殖和傳代培養，是首個海洋貝類的連續細胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細胞建系具有重要的指導意義。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內 。
權利要求
1.一種柿孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法,其特征在于，該培養方法包括以下步驟 將單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有O. 5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23°C的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞； 根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代； 當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。
2.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。
3.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基由L15基礎培養基、5%胎牛血清、I %櫛孔扇貝血清、2毫摩爾谷氨酰胺、100單位/暈升青霉素、100微克/暈升鏈霉素構成。
4.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，步驟五，當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養的實現方法為 當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，用移液管輕輕吹打或用細胞刮刀刮取獲得解離的單個細胞，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，再平均分散在兩個細胞培養瓶中完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。
5.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，體外培養的細胞取自櫛孔扇貝晚期胚胎、擔輪幼蟲、D型幼蟲的細胞，同時該培養方法也可應用在其他種類貝類生物胚胎和幼蟲細胞的培養中。
6.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞時，在4°C下培養1-2天，原代培養的櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞可存活且可抑制細菌污染，再轉到17-25°C培養箱中，細胞也可實現穩定傳代培養。
7.如權利要求I所述的培養方法，其特征在于，在櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞培養早期，使用聞濃度的青鏈霉素雙抗液，青霉素濃度為2500單位/暈升至25000單位/暈升,鏈霉素濃度為2500微克/毫升至25000微克/毫升鏈霉素。
8.如權利要求3所述的培養方法，其特征在于，所述櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基中添加物的最寬范圍胎牛血清添加量2% -20%，扇貝血清1% -10%，青霉素100-500單位/毫升、鏈霉素100-500微克/毫升。
全文摘要
本發明公開了一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，櫛孔扇貝擔輪幼蟲專用細胞培養基中添加維持細胞代謝需求的少量營養因子，即實現了櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的良好生長狀態，隨著細胞的分裂能夠實現細胞的穩定傳代培養，操作簡單且成本低廉，同時采用櫛孔扇貝擔輪幼蟲專用無鈣海水等滲緩沖液浸泡與機械法結合的方式實現了對細胞的完全解離，無需經任何酶類的消化，該培養方法對櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的損傷小，成本低效率高，具有可重復性，本發明建立了一種穩定的海洋無脊椎動物細胞體外培養的方法，能夠實現細胞的體外增殖和傳代培養，是首個海洋貝類的連續細胞系，對除櫛孔扇貝之外的其他貝類細胞建系具有重要的指導意義。
文檔編號C12N5/07GK102965331SQ20121048014
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者張志峰, 晏萌, 季愛昌, 畢穎 申請人:中國海洋大學