專利名稱：磁性納米載體介導的植物轉基因方法
技術領域：
本發明涉及納米生物技術和生物納米材料應用等領域，具體指一種以磁性納米載體介導的植物轉基因方法。
背景技術：
植物基因工程是應用重組DNA技術，將外源基因導入到受體植物細胞內，使受體植物獲得新的遺傳性狀。20世紀80年代，在細胞和組織培養、分子生物學研究領域取得一系列重大進展的基礎上，植物基因工程到得到了迅猛的發展。棉花是我國重要的經濟作物，對農業和棉紡行業的發展具有舉足輕重的作用，但傳統的育種方法多限于品種間或種間的染色體重組，具有很大的局限性。因此利用基因工程技術培育棉花新品種具有十分重要的意義。我國棉花生物技術研究起始于20世紀70年代，近年來隨著植物轉基因研究的蓬勃發展，轉基因技術的不斷改進和完善，轉基因技術已經應用于棉花抗蟲、抗除草劑、抗病、提高產量和品質改良育種的實踐中，并得到了抗蟲、抗除草劑、抗病等轉基因新品種(系)，有些已經進入商品化生產，取得了顯著的經濟效益和社會效益，特別是中國農業科學院郭三堆等科學家培育成功的轉基因抗蟲棉的大面積推廣，極大地促進了我國棉花產業的發展，不僅使棉花產量得到了顯著提高，也大量減少了殺蟲劑的使用，充分體現了轉基因作物在農業生產中重要的經濟與社會價值。因此，充分運用轉基因技術，在高產、優質的棉花品種上，進一步導入抗病蟲、抗除草劑、耐鹽堿、耐干旱等基因，獲得抗逆性優良的轉基因棉花種質新材料，對轉基因棉花新品種具有重要的現實意義。應用于棉花的轉基因技術主要有農桿菌介導的外源基因導入方法、外源基因直接導入的花粉管通道法和基因槍法，這三種方法也是應用最廣泛的植物遺傳轉化手段。自從1987年Umbeck和Firoozababy等通過根癌農桿菌介導轉化獲得第一個表達外源基因的轉基因植物以來，該方法在棉花遺傳轉化中得到了迅速應用。當前通過各種轉基因技術已獲得的近200種轉基因植物，其中80%以上是利用根癌農桿菌轉化方法獲得的。該方法以轉基因低拷貝、遺傳穩定性好、能夠轉化大片段的DNA、轉化效率高等優點倍受人們的關注，是目前轉化機理研究最清楚，應用最廣泛的方法。棉花的遺傳轉化采用的根癌農桿菌為土壤喜居菌，革蘭氏染色呈陰性(李俊蘭，2002)。利用農桿菌轉移外源基因的過程一般是(I)將目的基因導入中間載體或二元載體；(2)將帶有目的基因的中間載體或二元載體導入農桿菌；(3)使農桿菌感染寄主(受體)植物細胞或組織；(4)篩選轉化細胞并誘導其再生植株；(5)對轉基因植株進行分子檢測。農桿菌介導的基因轉移所適用的外植體非常廣泛，包括葉片、莖段、胚軸、葉柄、子葉、幼胚或成熟種子。在棉花上常用的為下胚軸。但是，影響農桿菌介導法的因素較多，主要有外植體類型和生理狀態、外植體是否進行預培養、Vir基因活化狀況、pH值、溫度、滲透壓、肌醇濃度以及一些糖類。棉花農桿菌介導遺傳轉化方法，由于其轉化受體材料嚴格受基因型的限制、通過再生途徑獲得的轉基因苗周期長、獲得轉基因苗由于其脫分化和再分化導致體細胞變異而突變率高等因素，制約了農桿菌介導的遺傳轉化方法在棉花基因工程中的應用。
花粉管通道途徑(pollen tube pathway)是周光宇等人(1978)提出DNA片段雜交理論之后設計的自花授粉后外源DNA導入植物的轉基因技術。棉花胚珠在授粉之前，珠心是一個封閉的體系，授粉后隨花粉管的伸入，從珠孔到胚囊的一些珠心細胞退化形成一條通道，以利于花粉管進入胚囊，外源DNA可以通過花粉管通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞從而參與到新形成的種子中。由于這些細胞不具備正常的細胞壁，可作為天然的原生質體，易于DNA轉化，受精后細胞DNA復制活躍，易于外源DNA的整合。用同位素示蹤技術已經證實外源DNA是通過花粉管通道而不是通過花粉管進入胚囊的(龔蓁蓁，1988 ;黃國存，1998)。黃駿麒等(1981)應用花粉管通道法成功地將抗病基因導入高產、優質、感病的棉花品種中，獲得耐黃萎病、抗枯萎病的棉花3118新品種。倪萬朝等(1998)通過花粉管通道法將Bt基因導入泗棉3號，選育出了我國第一批通過審定的轉基因抗蟲棉GKl。花粉管通道法應用于棉花基因工程，不僅打破了轉化受體材料的基因型限制，無需大型儀器設備，而且整個轉化過程在大田中實施、對轉化條件要求比較簡單、由轉基因材料培育出新品種的周期短，可直接獲得正常種子，因此在國內棉花遺傳轉化中得到了廣泛的應用。但是，該方法轉化后對子房機械損傷大，單棉鈴的得籽率較低(單棉鈴可收10粒以下種子)，轉化效率較低(按照轉化的花朵數算，其轉化效率O. 03% O. 1%左右)，工作量大，轉化用的載體骨架結構也整合于棉花基因組中，獲得的轉基因材料中外源DNA—般為多拷貝，后代純合速度較慢。基因槍法又稱粒子轟擊法，是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細胞的一種轉化技術。其基本原理是通過火藥爆炸高壓放電或高壓氣體作為動力加速帶有基因的金屬顆粒(如金粒或鎢粒)使其進入帶壁細胞。在此過程中質粒首先沉淀在微彈(金粒或鎢粒)表面，結合有DNA分子的微彈經加速而獲得足夠的動量，進而穿透植物細胞壁進入靶細胞，隨后釋出DNA分子并隨機的整合到寄主的基因組內。Finer和Mullen (1990)以棉花胚性懸浮細胞為轉化受體最先用基因槍法將⑶S和NPT II基因導入到棉花中，成功地獲得了轉基因棉花；吳敬音等(1994)應用基因槍轟擊法將CPTI基因和NPT II基因的重組質粒導入到棉花莖尖分生組織，培養獲得卡那霉素抗性植株；劉傳亮等(2003)采用基因槍導入技術將外源導入受體棉花品種的莖尖或莖尖分生組織，成功地育成轉基因棉花品種(系)。基因槍法由于將整個質粒表達載體通過金屬顆粒引入細胞中，獲得的轉基因材料外源DNA—般為多拷貝，表達載體骨架結構序列也整合于基因組中；該方法也需要受體材料通過組織培養過程獲得再生苗，導致轉化受體材料嚴格受基因型的限制、通過再生途徑獲得的轉基因苗周期長、獲得轉基因苗由于其脫分化和再分化引起體細胞變異而突變率高；轉化用的金屬顆粒比較昂貴，技術成本較高。因此該方法在棉花遺傳轉化中應用較少。磁性納米顆粒作為基因載體在動物和人體細胞的基因轉導已經取得了成功，在基因轉導和基因治療等方面顯示了廣闊的應用前景(Soeren，2004 ;莊乾元，2007)。磁性納米顆粒作為基因載體的優點主要表現在(1)磁性納米載體為非病毒載體，無免疫原性；(2)磁性納米載體的比表面積大，能裝載大量的大片段DNA ；(3)磁性納米載體表面修飾帶正電的PEI基團，能有效結合帶負電的DNA ； (4)磁性納米載體結合DNA能夠使其免遭組織細胞中各種補體以及各種酶的破壞，且納米載體還可以介導外源基因在細胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉基因長期穩定的表達；(5)磁性納米載體具有超順磁性，在磁場作用下能運
4送基因到目標位置，具有靶向性，能夠人為進行操縱；(6)在磁性納米顆粒表面常包覆一些生物材料，具有良好的生物相容性。利用納米顆粒作為基因載體，將外源基因轉入植物細胞，能夠克服傳統的植物轉基因方法的不足。Torney等(2007)利用中孔氧化硅微米顆粒為載體，攜帶外源基因物質，成功實現了 GFP在煙草原生質體(Nicotiana tabacum)中的表達,首次將納米基因載體帶入植物細胞生物學的領域，研究指出納米載體具有極大的比表面積，能夠包裹大片段的DNA及調控物質，進入植物細胞，并實現調控表達。此外，Vijayakumar等(2010)利用納米載體成功將外源基因導入水稻、煙草、銀合歡等多種植物，納米載體不存在宿主限制，并且當載體小到納米級別后，其具有更高的穿透能力，能夠有效進入植物細胞。王鳳華等(2010)以磁性納米顆粒為載體，用電擊法介導基因導入水稻懸浮細胞，并獲得瞬時表達，磁性納米顆粒經過修飾，具有良好的生物相容性，并且對裸露的DNA起到保護作用，有效提高了轉化效率。然而，利用磁性納米基因載體轉染植物花粉的研究未有人報道。

發明內容
一種磁性納米載體介導的植物轉基因方法，具體包括，將具有順磁性、表面覆蓋一層PEI薄膜的磁性納米載體與外源基因相結合，構建出基因一納米磁顆粒載體復合物，將基因一納米磁顆粒載體復合物與植物花粉或花藥共培養，并以O. Γο. 5T的磁場介導，進而將基因一納米磁顆粒載體復合物轉入植物花粉或花藥細胞，通過植物授粉和受精過程實現外源目的基因的遺傳轉化。在本發明中，基因一納米磁顆粒載體復合物轉化的植物材料為花粉或者花藥，如含有基因一納米磁顆粒載體復合物的花粉在授粉受精過程中，將目的基因導入受精卵并整合于染色體DNA，最后發育成含有目的基因的種子。本發明找出O. ΓΟ. 5T這個合適的磁場范圍，而成功實現驅動磁性納米載體DNA復合物進入花粉或花藥細胞。棉花、油菜、玉米等重要農作物花粉粒大、花粉數量多、易于收集，其萌發孔區域細胞壁較薄；納米載體粒徑小，具有較高的滲透性，磁性納米載體處理植物花粉在不損傷花粉的前提下使它能攜帶外源DNA，隨花粉管生長順利進入胚囊，形成合子，從而直接得到轉基因種子。此方法形成轉化合子的機率大，對細胞的損傷小，操作簡單，轉化率較高，遺傳穩定性好。本發明是利用磁性納米基因載體的超順磁性和生物相容性，有效攜帶外源目的基因轉染植物花粉，顯著的提高了植物細胞的基因轉化效率，從而建立了基于磁性納米基因載體的植物轉基因方法。本發明首次將磁性納米基因載體應用到植物花粉的基因轉導，建立了一種全新的磁場驅動下納米磁性顆粒作基因載體的植物轉基因方法。本發明方法具有操作簡便、轉導效率高和不受基因種類和數量限制等優點，可以廣泛應用于植物轉基因技術。在本發明中,優選該磁性納米載體粒徑在10_500nm之間,該磁性納米載體為天然的、人工合成的或從生物體內分離制備的。該磁性納米載體在磁場驅動下，能攜帶外源目的基因定向進入植物細胞。更優選該磁性納米載體為Fe3O4顆粒。在本發明中，優選的是，磁性納米載體與外源基因按照質量比5: f 1:20混合進行偶聯，更優選該比值為2:f 1:5。本發明通過控制與納米磁性載體結合的外源基因的量，使得轉入的外源基因的拷貝數得到有效地控制。在本發明中，優選所述磁性納米載體與外源基因通過靜電吸引作用相結合。磁性納米載體能夠在靜電吸引作用下，將如為DNA的外源基因吸附至表面PEI薄膜的孔隙內。優選所述外源基因為質粒DNA、線性DNA、基因組DNA或RNA，且所述外源基因為單基因、多基因或混合質粒DNA ;其中，該混合質粒DNA例如為文庫。在本發明中，所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，且優選所述植物為棉花、油菜、黃瓜、西紅柿、煙草、水稻或玉米。另外，優選所述植物為健壯的完整開花植株，其授粉部位為經過去雄并生殖隔離的柱頭。本發明的優點為首先，本發明轉染方法操作簡單，易于掌握，便于推廣。其次，本發明的轉染方法不受外源基因種類和大小限制，不要求有受體細胞特異性，可廣泛應用于植物轉基因技術。再次，在本發明轉染方法中，用納米磁性粒子作基因載體，在磁場的介導下，外源目的基因進入花粉，整合到細胞基因組，顯著提高了基因的轉化效率。最后，本發明通過控制與納米磁性載體結合的外源基因的量，可有效地控制轉入的外源基因的拷貝數。


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I為與實施例I相應的不同重量比的納米載體/質粒pGBIF4ABC-a凝膠電泳
2為實施例I中卡納霉素進行篩選最終獲得的Ttl代陽性棉花植株的照片；
3為實施例I中Ttl代陽性棉花植株PCR檢測結果；
4為實施例I中T1和T2代棉花葉片DNA的Bt基因穩定性Southernblot分析；5為與實施例2相應的不同質量比的納米載體/pK7G-HSERK的凝膠電泳6為與實施例3相應的不同質量比的納米載體/BAC的凝膠電泳7為與實施例4相應的不同質量比的納米載體/線性DNA的凝膠電泳圖。
具體實施例方式實施例I納米Fe304/PEI基因載體介導雙基因轉化棉花花粉細胞將棉花抗蟲質粒(PGBIF4ABC- a，其含轉化Bt和Cpti融合抗蟲基因植物表達載體，卡那霉素抗性標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，具體步驟如下。a :受體材料開花前一天去雄，用細管套住柱頭生殖隔離，防止其他花粉污染；b :摘取當天開放但未散粉的花朵，取出花藥；c :將質粒PGBIF4ABC- α與納米載體Fe304/PEI按質量比2 :1連接，即每50ul體系中含有Iul (lug/ul)磁性納米粒和2ug質粒DNA,室溫連接30min ；d :將步驟c的體系稀釋1000倍,將步驟b取得的花藥浸泡其中，每IOOml處理10個花藥，置于O. 3T的磁場下，驅動磁性納米載體DNA復合物進入花粉細胞，處理30min ；e :取出花藥，吸水紙吸干花藥殘留的液體，置于陽光下晾曬，等待花粉散出后收集花粉，裝入授粉瓶；f :田間授粉，將步驟a中去雄并生殖隔離柱頭的細管拔掉，將步驟e所得花粉涂抹在柱頭上，再用細管套住，防止其他花粉污染，并做好標記；g :棉花自然成熟后收猶種子，播種后待弟~■片真葉出來后，將IOOOppm的卡那霉素涂抹于葉片上進行篩選，未出現黃斑的植株即為候選陽性植株；將獲得的候選陽性植株，在長出第四片真葉和第八片真葉時分別利用卡納霉素再進行兩次篩選，獲得Ttl代陽性植
6株，其照片如圖2所示；h :摘取Ttl代陽性植株葉片，提取基因組DNA，利用Bt基因引物進行PCR檢測，結果圖見圖3，最終確定陽性植株，該方法轉化效率為10%。i :篩選獲得的性狀優良的Ttl代植株種子，播種后按照Ttl代卡納霉素和分子檢測篩選方法繼續篩選，獲得T1代轉基因材料，收取種子后繼續篩選獲得穩定表達抗蟲基因的T2代轉基因棉花植株材料。圖4相應的T1和T2材料中Bt基因Southern blot分析表明Bt基因在1\、T2代棉花植株中能夠穩定遺傳。圖I顯示了不同重量比的納米載體/質粒pGBIF4ABC_a復合物凝膠電泳圖，圖I中將納米載體與質粒DNA按一系列質量梯度比例連接，即MNPs =DNA依次為0:1、2:1、1: I、1: 5、1:10、1:20和1:40 ;DNA若能與納米載體完全結合，則DNA滯留在點樣孔中不能顯現出條帶，如圖中的2:1和I: I。從圖中可以看出，納米載體與DNA能很好地結合,隨著DNA用量的增大，至MNPs與DNA的質量比為1:20時，DNA明顯不能與納米載體完全結合，出現條帶。在實施例I中為使DNA在完全與納米載體結合的前提下使得載體盡量多攜帶DNA，因而選擇MNPs DNA為1:2,即質粒與載體的比例為2:1進行上述實驗。圖2為卡納霉素進行篩選最終獲得的Ttl代陽性棉花植株的照片。圖3為Ttl代陽性棉花植株PCR檢測結果；具體為，提取Ttl代陽性棉花植株葉片基因組DNA，利用Bt基因引物進行PCR檢測，結果顯示目的基因Bt成功整合到細胞基因組中。圖4為T1和T2代轉基因棉花植株材料的葉片基因組DNA的Bt基因穩定性Southern blot分析；其中1、3、5泳道為T1代，2、4、6泳道為T2代；從圖中結果表明轉入的外源Bt基因在1\、T2代棉花植株中能夠穩定遺傳。實施例2納米Fe304/PEI基因載體介導單基因轉化棉花花粉細胞棉花體細胞胚發育相關基因(pK7G-HSERK，卡那霉素抗性標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與實施例I步驟a至i相同。圖5顯示了不同質量比的納米載體/pK7G-HSERK復合物的凝膠電泳圖。最終統計出本實施例中的轉化效率為2%。實施例3納米Fe304/PEI基因載體介導多基因人工染色體轉化棉花花粉細胞棉花基因組DNA細菌人工染色體(BAC，含氯霉素標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與實施例I步驟a至i相同；不同的是，在步驟c中采用BAC與納米載體按質量比I :I連接。圖6顯示了不同質量比的納米載體/BAC復合物的凝膠電泳圖。最終統計出本實施例中的轉化效率為10%。實施例4納米Fe304/PEI基因載體介導線性DNA轉化棉花花粉細胞草苷膦抗性基因(線性DNA，含卡那霉素標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與實施例I步驟a至i相同。圖7顯示了不同質量比的納米載體/線性DNA復合物的凝膠電泳圖。最終統計出本實施例中的轉化效率為10%。對比例I農桿菌子房注射法a :用凍融法將質粒pGBIF4ABC- α轉入農桿菌LBA4404，制備工程農桿菌；b :挑取工程農桿菌菌落于YEB液體培養基(卡那霉素50 μ g · ml/1 +硫酸鏈霉素 50 μ g ι Γ1+ 利福平 50 μ g .mr1)搖瓶培養(200r .mirT1) 18h 左右，直到 0D600 值為 O. 8(細菌濃度為106 107cell mL—1，稀釋法確定細菌濃度);c :在搖好的菌液中加入乙酰丁香酮
7(30mg .L—1)再置于搖床中培養2h，取100 μ L菌液，650 μ L蔗糖溶液(5%)，250 μ L甘油(60%)混合，4°C保存；d :在注射前3d，將含有目的基因的農桿菌活化，于28°C培養箱，YEB固體培養基上長出直徑為Imm的單菌落；e :注射當天，測菌液OD值，用5%的蔗糖溶液稀釋到IO5個/mL，加入乙酰丁香酮(O. Immol · Γ1)、Silwet L77 (O. 05%)混勻；f :上午 9:00-10:00，溫度25 3(TC之間，于田間選擇果枝和花位較好的子房作為轉化對象，以植株中部果枝的子房為好；將雄蕊和花冠剝離，右手持微量注射器，左手輕扶摘除花瓣后的子房，用微量進樣器從柱頭處沿子房的縱軸方向順著花柱注入子房2/3處，垂直注射一半菌液，再拔出1/3，垂直注射另一半菌液，不能損傷子房室，共注射菌液10μ L ;g :注射后的棉鈴掛好標牌，棉花自然成熟后收獲種子。最終統計出其轉化效率為1%。對比例2雙基因DNA直接轉化棉花花粉細胞棉花抗蟲基因質粒(PGBIF4ABC- α，其含轉化Bt和Cpti融合抗蟲基因植物表達載體，卡那霉素抗性標記)直接轉化棉花，具體步驟如下。a :受體材料開花前一天去雄，用細管套住柱頭生殖隔離，防止其他花粉污染；b :摘取當天開放但未散粉的花朵，取出花藥；c :將質粒pGBIF4ABC- α稀釋至O. 2ug/uL ；d :將步驟b取得的花藥浸泡至c溶液中，每IOOml處理10個花藥，處理30min ；e :取出花藥，吸水紙吸干花藥殘留的液體，置于陽光下晾曬，等待花粉散出后收集花粉，裝入授粉瓶；f :田間授粉，將步驟a中去雄并生殖隔離柱頭的細管拔掉，將步驟e所得花粉涂抹在柱頭上，再用細管套住，防止其他花粉污染，并做好標記；g:棉花自然成熟后收獲種子，播種后待第二片真葉出來后，將IOOOppm的卡那霉素涂抹于葉片上進行篩選，未出現黃斑的植株即為候選陽性植株；將獲得的候選陽性植株，在長出第四片真葉和第八片真葉時分別利用卡納霉素再進行兩次篩選，獲得TO代陽性植株。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例3單基因質粒直接轉化棉花花粉細胞棉花體細胞胚發育相關基因(PK7G-HSERK，卡那霉素抗性標記)直接轉化轉化棉花花粉，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例2步驟a至g相同。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例4多基因細菌人工染色體質粒直接轉化棉花花粉細胞棉花基因組DNA細菌人工染色體(BAC，含氯霉素標記)直接轉化轉化棉花花粉，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例2步驟a至g相同。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例5線性DNA直接轉化棉花花粉細胞草苷膦抗性基因(線性DNA，含卡那霉素標記)直接轉化轉化棉花花粉，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例2步驟a至g相同。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例6無磁場條件下，納米Fe304/PEI基因載體介導雙基因轉化棉花花粉細胞將棉花抗蟲質粒(PGBIF4ABC- α，其含轉化Bt和Cpti融合抗蟲基因植物表達載體，卡那霉素抗性標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，具體步驟如下。a :受體材料開花前一天去雄，用細管套住柱頭生殖隔離，防止其他花粉污染；b :摘取當天開放但未散粉的花朵，取出花藥；c :將質粒pGBIF4ABC- α與納米載體Fe304/PEI按質量比2 1連接，即每50ul體系中含有Iul
8(lug/ul)磁性納米粒和2ug質粒DNA,室溫連接30min ；d :將步驟c的體系稀釋1000倍,將步驟b取得的花藥浸泡其中，每IOOml處理10個花藥，處理30min ；e :取出花藥，吸水紙吸干花藥殘留的液體，置于陽光下晾曬，等待花粉散出后收集花粉，裝入授粉瓶；f :田間授粉，將步驟a中去雄并生殖隔離柱頭的細管拔掉，將步驟e所得花粉涂抹在柱頭上，再用細管套住，防止其他花粉污染，并做好標記；g:棉花自然成熟后收獲種子，播種后待第二片真葉出來后，將IOOOppm的卡那霉素涂抹于葉片上進行篩選，未出現黃斑的植株即為候選陽性植株；將獲得的候選陽性植株，在長出第四片真葉和第八片真葉時分別利用卡納霉素再進行兩次篩選，獲得TO代陽性植株。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例7無磁場條件下，納米Fe304/PEI基因載體介導單基因轉化棉花花粉細胞棉花體細胞胚發育相關基因(PK7G-HSERK，卡那霉素抗性標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例6步驟a至g相同。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例8無磁場條件下，納米Fe304/PEI基因載體介導多基因人工染色體轉化棉花花粉細胞棉花基因組DNA細菌人工染色體(BAC，含氯霉素標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例6步驟a至g相同；不同的是，在步驟c中采用BAC與納米載體按質量比I :1連接。最終統計出本例中的轉化效率為0%。對比例9無磁場條件下，納米Fe304/PEI基因載體介導線性DNA轉化棉花花粉細胞草苷膦抗性基因(線性DNA，含卡那霉素標記)與磁性納米粒連接后轉化棉花，其轉化和遺傳鑒定步驟與對比例6步驟a至g相同。最終統計出本例中的轉化效率為0%。表I
權利要求
1.一種磁性納米載體介導的植物轉基因方法，其特征在于將具有順磁性、表面覆蓋一層PEI薄膜的磁性納米載體與外源基因相結合，構建出基因一納米磁顆粒載體復合物，將基因一納米磁顆粒載體復合物與植物花粉或花藥共培養，并以O. Γθ. 5T的磁場介導，進而將基因一納米磁顆粒載體復合物轉入植物花粉或花藥細胞，通過植物授粉和受精過程實現外源目的基因的遺傳轉化。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于該磁性納米載體粒徑在10-500nm之間，為天然的、人工合成的或從生物體內分離制備的。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于磁性納米載體與外源基因按照質量比5:1 1:20混合進行偶聯。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于磁性納米載體與外源基因按照質量比2: f 1:5混合進行偶聯。
5.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述磁性納米載體與外源基因通過靜電吸引作用相結合。
6.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述外源基因為質粒DNA、線性DNA、基因組DNA或RNA，所述外源基因為單基因、多基因或混合質粒DNA。
7.根據權利要求1飛中任意一項所述的方法，其特征在于所述植物為健壯的完整開花植株，其授粉部位為經過去雄并生殖隔離的柱頭。
8.根據權利要求Γ6中任意一項所述的方法，其特征在于所述植物為棉花、油菜、黃瓜、西紅柿、煙草、水稻或玉米。
全文摘要
本發明提供一種磁性納米載體介導的植物轉基因方法，具體包括將具有順磁性、表面覆蓋一層PEI薄膜的磁性納米載體與外源基因相結合，構建出基因－納米磁顆粒載體復合物；將基因－納米磁顆粒載體復合物與植物花粉或花藥共培養，利用磁性納米載體的高穿透性，在0.1~0.5T的磁場的驅動下，將基因－納米磁顆粒載體復合物轉入植物花粉或花藥細胞，通過授粉受精過程實現外源目的基因的遺傳轉化。本發明方法操作簡單、易于掌握、便于推廣、不受外源基因種類和大小限制、打破了受體材料遺傳背景的限制、直接獲得轉基因種子、獲得轉基因材料的時間短、轉化效率高，可廣泛應用于植物遺傳轉化。尤其對重要農作物的遺傳改良和功能基因組的研究具有重大價值。
文檔編號C12N15/87GK102925488SQ20121048723
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年4月28日
發明者崔海信, 孟志剛, 郭三堆, 孫長嬌, 王琰, 趙翔 申請人:中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所