專利名稱：產(r, r)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種產{R，奶-2，3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法和應用。
背景技術：
2，3- 丁二醇(2，3-Butanediol)是一種重要的化工原料，廣泛應用于化工、食品、燃料以及航空航天等多個領域，具有良好的應用前景；同時，通過特定的化學反應，2，3- 丁二醇可以衍生出多種重要的化學品如3-羥基丁酮、甲乙酮及1，3-丁二烯。因此，它被視作一種極具潛力的平臺化合物。
2，3-丁二醇分子內含有兩個手性碳原子，因此存在三種立體異構體。其中{R，R)~2, 3- 丁二醇不僅具有混旋型2，3- 丁二醇的一般功能，而且還可以用于制備手性化學品以及作為高級防凍劑。目前，{R,R)-2, 3- 丁二醇的生產主要采用化學合成法，先由I- 丁醇脫水得1_ 丁烯，再經加成得2-氯-丁烷，再消除得2- 丁烯，再與次溴酸反應生成3-溴-2- 丁醇，然后在堿液中水解可得到2，3-丁二醇的外消旋混合物，最后通過外消旋體的拆分得到{R，7 ) 2，3-丁二醇(紀曉俊，聶志奎，黎志勇，高振，黃和.化學進展，2010，22:2450-2461);但是化學合成法過程繁瑣，最后還需要通過化學法進行手性拆分，因此成本高、難以實現大規模生產。在制備化學品的方法中，微生物制造方法與化學合成法相比，其原料豐富、工藝簡單、環境友好，因此越來越受到各國科學家的青睞。據報道，傳統的天然微生物一般都生成兩種不同構型2，3- 丁二醇的混合物，至今還沒有發現單一生成某種構型2，3- 丁二醇的微生物(CeliAska E, Grajek, ff. Biotechnol Adv, 2009, 27: 715 - 725)。利用傳統的天然微生物發酵法難以實現單一構型的2，3-丁二醇的高純積累，而且由于不同立體構型2，3- 丁二醇的物理化學性質十分相近，實現其分離很困難，故通過構建能夠產單一構型2，3- 丁二醇的基因工程菌則有望解決該問題。據報道，目前構建出的基因工程菌都只能在IPTG存在的情況下表現出較強的外源蛋白表達和目標產物積累的能力，且產^奶-2，3-丁二醇的能力均偏低。誘導劑對細胞的生長有一定的抑制作用，且價格相對昂貴，若利用基因工程菌進行工業化生產，誘導劑的添加必會大幅增加成本，不利于{R，奶-2，3-丁二醇的規模化生產。

發明內容
本發明的目的是提供產^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，該基因工程菌能在不添加任何誘導劑的情況下發酵產高純度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。本發明的另一目的是提供上述基因工程菌的構建方法，該方法簡單，效率高。本發明的再一目的是提供上述基因工程菌在制備{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的應用，該制備方法簡單，產率高，對環境友好，成本低廉。本發明的目的采用如下技術方案實現。
產汰7 )-2，3-丁二醇的基因工程菌，是將如00基因、如說基因和_70^基因通過表達載體導入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌為大腸桿菌{Escherichia coif) MG1655。所述表達載體為pTrc99a。一種構建所述產{R，R)~2, 3- 丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步驟
(1)從肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分別擴增Zwt/i 基因和基因，從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) 168中擴增基因；
(2)利用重疊延伸PCR技術將budB基因、budA基因和JOrJZ基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因；
(3)將所述融合基因插入表達載體的多克隆位點處，得到重組質粒；
(4)將所述重組質粒導入宿主內即得所述產{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。步驟(I)中用于擴增too 基因的引物為Pl和P2 ;用于擴增基因的引物為P5和P6 ;用于擴增基因的引物為P9和PlO ；
所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分別為
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，
P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。步驟(2)的具體方法為
(1)將步驟(1)所得如必基因
與pMD 18-simp Ie-T載體相連獲得重組質粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4為引物擴增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下
P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
(II)將況/說基因與載體pMD18-simp Ie-T相連,獲得重組質粒pMD18-simple-T-/wo^,以P7和P8為引物擴增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；
(III)將ydjL 基因與載體 pMD 18-simp Ie-T 相連,獲得重組質粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12為引物擴增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；
(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進行擴增，獲得擴增產物I ;以所述擴增產物I為模板，以P7及P12為引物擴增獲得ZwW基因與基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；以budA基因與_7心1基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進行擴增，獲得擴增產物2 ;以擴增產物2為模板，P13及P14為引物，進行擴增，獲得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下
P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’，
P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。一種所述基因工程菌在制備(M，奶-2，3-丁二醇方面的應用，將基因工程菌接種至發酵培養基，在搖床轉速18(T220r/min、35_38°C條件下發酵3(T48h，收獲含有{R，R)~2, 3-丁二醇的發酵液；
所述發酵培養基為葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏T7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨芐青霉素20 50 Pg/mL，溶劑為水。有益效果
本發明基因工程菌性質穩定，在不添加誘導劑的情況下，以葡萄糖為底物高產高純度的說奶_2，3-丁二醇，突破了以往報道基因工程菌需要添加誘導劑的限制。搖瓶發酵結果該基因工程菌可利用80g/L葡萄糖，產出32. 2g/L的{R, R) -2，3- 丁二醇，對映體純度高達99. 5%，相對于葡萄糖的轉化率為40. 3%，理論最高轉化率為50% ;在上述相同條件下，原始菌株幾乎不耗糖，與原始的大腸桿菌菌株相比，在導入有效的^ 7 )-2，3_丁二醇合成途徑后，重組菌不僅實現了 {R，奶_2，3-丁二醇從無到有的合成，而且也不需要誘導劑的作用。與目前文獻報道的大腸桿菌產汰奶-2，3-丁二醇產量相比，產物終濃度也是相對最聞的。本發明構建基因工程菌的方法，巧妙、簡單、效率高。本發明基因工程菌用于發酵制備{R，奶_2，3-丁二醇，方法簡單，產率高，對環境友好，成本低廉。發酵液中僅存在單一構型的、R，奶_2，3-丁二醇，因此不需要復雜的拆分步驟。在發酵過程中，不需要添加誘導劑IPTG，成本低。


圖I為budB、budA和_7<3冗這三種基因的拼接模式示意圖。圖2為三種外源基因在宿主細胞coli MG1655中成功表達的SDS-PAGE圖譜；M為SDS-PAGE低分子量Marker ；Lane I為添加了誘導劑IPTG的原始菌；Lane 2未經IPTG誘導的基因工程菌；Lane 3為IPTG誘導的基因工程菌。圖3 ■、職Escherichia coli MG1655的發酵液高效液相色譜圖。圖 4 為基因工程菌coli加 IPTG 誘導情況下的發酵液高效液相色譜圖，其中I是3-羥基丁酮；2是汰7 )-2，3_ 丁二醇。圖5 為基因工程菌coli"^無 IPTG 誘導情況下的發酵液高效液相色譜圖，其中I是3-羥基丁酮；2是iR，R)~2, 3- 丁二醇；3是乙醇。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅限于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。本發明中的生物材料來源如下
Klebisella pneumoniae CICC10011 菌株(縮寫為尤 pneumoniae CICC10011 菌株):購于中國微生物菌種保藏中心；
枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is) 168 (縮寫為B. subtil is 168菌株)購于中國工業微生物菌種保藏中心；
pMD 18-simp Ie-T載體商業載體，購于TaKaRa公司(寶生物工程有限公司)；
PUC18 :商業載體，購于TaKaRa公司(寶生物工程有限公司)； pTrc99a載體商業載體，購于上海北諾生物科技有限公司；
Escherichia coli MG1655 :由廣東菌種保藏中心代購于美國菌種保藏中心(編號ATCC 700926)。本發明中ZwoS基因為α -乙酰乳酸合成酶編碼基因，budA基因為α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基因，_7心1基因為^奶_2，3-丁二醇脫氫酶編碼基因。實施例I :重組質粒的構建
(I)基因too 的克隆
根據Genebank公布的肺炎克雷伯氏桿菌Of. pneumoniae)中基因序列設計合成引物
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’
以K. pneumoniae CICC10011菌株的基因組DNA為模板，應用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 進行 PCR 擴增 too 基因。PCR 反應體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，弓丨物 Pl O. 5 μ L，引物P2 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應程序98°C變性208，55 621退火30s，72°C延伸lmin48s，循環30輪；最后10 C保溫。將PCR產物以0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR純化試劑盒純化后，用TakaraDNA A-Tailing Kit在PCR產物3’端加A，然后與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質粒pMD 18-simple-T-Zwt/i ,進行序列測定。Zwt/i 基因的序列如SEQ ID NO: I所不。以重組質粒pMD18-simple-T-too0為模板，P3和P4為引物，應用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴增含有too 基因的拼接序列I。P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’ ；
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
PCR 反應體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，$*P3 0.5yL，$*P30. 5μ L, pMD18-simple-T-too0質粒DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0· 25 μ L。PCR程序為98°C變性10s，68°C退火加延伸2min，循環30輪；最后10°C保溫。反應結束后，0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經PCR純化試劑盒純化。拼接序列I用于之后的重疊延伸PCR反應，其組成是在too 基因的前端加了SacI酶切位點和RBS序列，在Zwi浴基因后端加了與拼接序列2前端相重疊的15 20bp。
(2)基因budA的克隆
根據Genebank公布的肺炎克雷伯氏桿菌Of. pneumoniae)中基因序列設計合成引物
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’。以尤pneumoniae CICC 10011菌株的基因組為模板進行PCR擴增，應用Takara高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴增基因。PCR 反應體系:ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 P5 O. 5 μ L，引物P6 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應程序98°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸48s，循環30輪；最后10°C保溫。 PCR產物以O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR純化試劑盒純化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR產物3’端加A，然后再與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質粒pMD18-simple-T-/w<i4,進行序列測定。基因的具體序列如SEQ ID N0:2所示。以重組質粒pMD18-simple-T-toi/ A為模板，P7和P8為引物，擴增含有to說基因的拼接序列2。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ 。PCR 反應體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ7 O. 5 μ L，弓I物 P8 O. 5μ L, pMD18-simple-T-too^ 質粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應程序為98°C變性10s，55 65°C退火15s，72°C延伸50s，循環30輪，最后10°C保溫。反應結束后，O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經PCR純化試劑盒純化。拼接序列2用于之后的重疊延伸PCR，其組成是在基因的前端加入SacI酶切位點，在況/說基因的后端具有與基因如段序列相重置的部分。(3)基因的獲取
根據Genebank公布的枯草芽孢桿菌(β· subtil is)中基因序列設計合成引物 P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。以B. subtilis 168菌株的基因組為模板進行PCR擴增，應用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴增基因。PCR 反應體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ9 O. 5 μ L，弓I物 PlO O. 5μ L, B. subtilis 168 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應程序981變性108，571退火158，721延伸11^11，循環30輪；最后10 C保溫。 PCR產物以O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，經PCR純化試劑盒純化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR產物3’端加Α，然后再與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質粒pMD18-simple-T-_Fi/jZ,進行序列測定。JOrJZ基因序列如SEQ ID N0:3所示。以重組質粒pMD18-Simple-T-j</Z為模板，Pll和P12為引物，擴增含有WjZ基因的拼接序列3。
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3> 。PCR 反應體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 Pll O. 5 μ L，引物 P12 O. 5μ L, pMD18-simple-T-_Fi/jZ 質粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應程序為98°C變性10s，59. 1°C退火15s，72°C延伸IminlOs，循環30輪，最后10°c保溫。反應結束后，0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經PCR純化試劑盒純化。拼接序列3用于之后的重疊延伸PCR，其組成是..電ydJL基因的前端具有與基因后段序列的相重疊部分，在_7心1基因的后端加入BamHI酶切位點。(4)重疊延伸PCR反應拼接to說基因和基因
重疊延伸PCR獲得ZwW基因與JOrJZ基因的融合基因，分為兩步反應。重疊延伸PCR第一步反應中，不加引物，以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進行擴增，每管的反應體系是ddH20 12 μ L7Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，拼接序列2和拼接序列 3 各 3 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 3 μ L。PCR 反應條件98°C 變性10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 IminlOs，循環 8 輪；10°C保溫。重疊延伸PCR的第二步反應中，將第一步反應產物稀釋100倍后作為模板，P7和P12為引物，擴增獲得ZwW基因與_7心1基因的融合基因。每管的反應體系是ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P7 O. 5yL，引物 Ρ12 0. 5yL,模板 2yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 25 μ L0 PCR 反應條件98°C變性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸2min，循環30輪，10°C保溫。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，,
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3，。P7引物前端有SacI酶切位點，P12引物后端有BamHI酶切位點。(5)重疊延伸PCR反應拼接budB基因、budA基因和70 基因
重疊延伸PCR獲得budB、budA、ydjL三種基因的融合基因，分為兩步PCR反應。重疊延伸PCR反應第一步中，不加引物，以Zw說基因與基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進行擴增，每管的反應體系是ddH20 12 μ L, Buffer 5 μ L,dNTP 2 μ L，budA基因與基因的融合基因3 μ L，3 μ L拼接序列1，PrimeSTAR HS DNAPolymerase O. 3 μ L ;反應程序為98°C 變性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 2min，循環 8輪，10°C保溫。重疊延伸PCR的第二步反應中，以第一步反應產物作為模板，P13及P14為引物，擴增獲得too 基因、budA基因和基因的融合基因。每管的反應體系是ddH2014. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P13 0. 5yL，引物 Ρ14 0. 5 μ L，第一步反應產物2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 25 μ L ;反應程序為98°C變性 10s，57°C 退火15s，72°C延伸4min，循環29輪，10°C保溫。P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3，P14 :5 ’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3，
這對引物前端有SacI酶切位點，后端有BamHI酶切位點。反應結束后，O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經PCR純化試劑盒純化。將PCR回收產物與pUC18載體連接獲得重組載體進行序列測定,發現序列正確。SacI 和 BamHI 酶切重組載體 ^MCVd-budBbudAydjL，回收和的融合基因(約3. 5Kb片段)；同時SacI和BamHI酶切pTrc99a載體，回收大片段產物；將雙酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下連接從而獲得重組質粒x^d-budBbudAydjL。budB基因、budA基因和基因的拼接模式見圖I。實施例2 :制備基因工程coli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL 利用電擊穿孔儀將重組質粒dBbudAydjL轉化大腸桿菌coli
MG1655，電轉化參數為電壓2. 5 kv，200 Ω，脈沖時間4. 5 msec。電擊轉化完畢，將經電擊處理過的coli MG1655涂布于含有50 Pg/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C培養12 16小時，然后挑取陽性轉化子，經質粒提取酶切驗證后，確定得到重組大腸桿菌，命名 ％ Escherichia coli WGl&^-plrd^a-budBbudAydjL。實施例3 基因工程菌coli Μ61655-ρΤιχ99Β-Α ￡/^ ο^/ ^ 的穩定性
考察方法 .洛Escherichia coli MG1655-pTrc99a-/wi/i /wiilF￡/jZ 接種至 3mL 不含氨節青霉素的LB培養基中，37°C下培養12h作為種子，轉種培養24h (即傳種20代)，轉種培養5次(即傳種100代)。將上述菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，從中挑取100個單菌落分別點在添加和不添加氨芐青霉素的LB平板上，37°C下培養12 16h，比較在添加和不添加氨芐青霉素的LB平板上的菌落數，即其穩定性。考察結果傳種100代之后，其質粒穩定性為99%。實施例4 :基因工程菌coli誘導后的蛋白表達考察
(1)出發菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL
(2)以誘導蛋白表達為目的的基因工程菌培養
培養基葡萄糖50 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3g/L, NaCl 5g/L,氨節青霉素20 Pg/mL,溶劑為水；
培養條件50mL培養基裝于250mL錐形瓶中，37°C、200rpm培養至0D_在O. 6^0. 8時加IPTG誘導，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培養8h，誘導外源蛋白充分表達。同時設立不用IPTG誘導的基因工程菌的培養作為對照。該培養過程中不添加IPTG，其他培養條件與IPTG誘導基因工程菌相同。(3)誘導后基因工程菌的細胞破碎取步驟(2)獲得的培養液3ml，4000rpm、4°C下離心5min，用pH7. 4的磷酸鈉緩沖液洗滌一次、重懸至3ml ;冰浴下超聲破碎細胞(2s，3s, 15min, 300W);然后 12000rpm, 4°C 下離心 20min,取上清；取 30ul 上清與 IOul4*SDS_PAGE loading buffer混合于滅菌的I. 5ml離心管，煮沸5min后放于_20°C冰箱備用。
(4)將煮沸后的樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察是否有外源蛋白表達。考察結果在SDS-PAGE圖譜(見圖2)中，可以看出對應IPTG誘導基因工程菌的泳道上，能夠看到表達的三種外源蛋白的明顯條帶；同時，可以發現IPTG誘導基因工程菌表達的目的蛋白量比未經IPTG誘導基因工程菌顯著增加。對比例I ·.原展·Escherichia coli MG1655誘導后的蛋白表達考察
(1)出發菌株-,Escherichiacoli MG 1655
(2)誘導蛋白表達為目的的原始菌培養
培養基葡萄糖50 g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水；
培養條件50mL培養基裝于250mL錐形瓶中，37°C、200rpm培養至0D_在O. 6^0. 8時加IPTG誘導，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培養8h，保證與基因工程菌的同等培養及誘導條件。(3)誘導后原始菌的細胞破碎取誘導后的培養液3ml，4000rpm、4°C下離心5min,用pH7. 4的磷酸鈉緩沖液洗漆一次、重懸至3ml ;冰浴下超聲破碎細胞(2s, 3s,15min, 300W);然后12000rpm, 4 °C下離心20min, 轉移上清；取30ul上清與IOul4*SDS_PAGE loadingbuffer混合于滅菌的I. 5ml離心管，煮沸5min后放于-20度冰箱備用。(4)將煮沸后的樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察原始菌的蛋白表達情況。考察結果原始菌的SDS-PAGE凝膠圖與基因工程菌的SDS-PAGE凝膠圖相比(見圖
2)，沒有發現三種外源蛋白的表達條帶。這種對比結果說明，基因工程菌中已經實現了原始菌中不存在的三種外源蛋白的成功表達。實施例5 :基因工程菌coli發酵產{R，奶-2，3_ 丁二醇
方法一
無 IPTG 誘導的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發酵產{R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出發菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養基蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L,NaCl 5g/L，氨芐青霉素2(^g/mL，溶劑為水； 培養條件50mL培養基裝于250mL錐形瓶中，培養溫度37°C，搖床轉速180r/min，培養
12h。(3)發酵培養
發酵培養基葡萄糖80 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, NaCl 5 g/L,氨節青霉素20Pg/mL，溶劑為水；
培養條件接種量5% (v/v)，發酵溫度37°C，全程不添加誘導劑，搖床轉速180r/min，發酵30h。設計基因工程菌在IPTG誘導條件下發酵的對照，基因工程菌在發酵培養基中培養至OD600在O. 6 O. 8時加IPTG誘導，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm誘導培8h，再轉回37°C、180rpm進行發酵，發酵總時間30h。其他培養條件同無IPTG誘導的基因工程菌。設計原始菌coli MG1655的對照,種子培養基和發酵培養基中均不添加氨芐青霉素，其它培養條件與無IPTG誘導的基因工程菌相同。發酵結果將發酵液離心后，采用高效液相色譜檢測。基因工程菌在沒有IPTG誘導的條件下，能將80g/L葡萄糖轉化得到32.28/1的汰奶-2，3_ 丁二醇(見圖5)。基因工程菌在有IPTG誘導的條件下，僅耗糖20g/L，生成iR，R)~2, 3- 丁二醇5. 7g/L(見圖4)。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測到iR，奶-2，3-丁二醇生成(見圖3)。{R, R)~2, 3- 丁二醇采用高效液相色譜檢測采用日本島津高效液相色譜儀，RID-10A示差折光檢測器，Aminex HPX-87H(美國Bio-Rad公司)色譜柱。柱溫箱溫度65°C，流動相為 O. 005 mol/L H2SO4,流速為 0.6 mL/min。
方法二
無 IPTG 誘導的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發酵產{R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出發菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養基蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L, NaCl 10 g/L，氨芐青霉素50 Pg/mL，溶劑為水；
培養條件50mL培養基裝于250mL錐形瓶中，培養溫度37 °C，搖床轉速220r/min，培養
16h。(3)發酵培養
發酵培養基葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L,NaCl 10 g/L，氨芐青霉素50 Pg/mL，溶劑為水；
培養條件接種量10%(v/v)，發酵溫度37°C，全程不添加誘導劑，搖床轉速220r/min，發酵48h。設計基因工程菌在加IPTG誘導條件下發酵的對照，基因工程菌在發酵培養基中培養至OD600在O. 6 O. 8時加IPTG誘導，IPTG的終濃度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm誘導培8h，再轉回37°C、220rpm進行發酵，發酵總時間48h。其他培養條件同無IPTG誘導的
基因工程菌。設計原始菌coli MG1655的對照,種子培養基和發酵培養基中均不添加氨芐青霉素，其它培養條件與無IPTG誘導的基因工程菌相同。發酵結果基因工程菌在沒有IPTG誘導的條件下，能將200 g/L葡萄糖轉化得到75. 5g/L的iR，R) -2，3- 丁二醇。基因工程菌在有IPTG誘導的條件下，僅耗糖38g/L，生成{R, R) _2，3- 丁二醇10. 6g/L。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測到{R，R) _2，3- 丁二醇生成。方法三
無 IPTG 誘導的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發酵產{R，R) ~2, 3- 丁二醇(1)出發菌株'Escherichia coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養基蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨芐青霉素35 Pg/mL，溶劑為水；
培養條件50mL培養基裝于250mL錐形瓶中，培養溫度37 °C，搖床轉速200r/min，培養
14h。
(3)發酵培養
發酵培養基葡萄糖140 g/L，蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨芐青霉素35 Pg/mL，溶劑為水；
培養條件接種量7. 5%(v/v)，發酵溫度37°C，全程不添加誘導劑，搖床轉速200r/min，發酵39h。設計基因工程菌在加IPTG誘導條件下發酵的對照，基因工程菌在發酵培養基中培養至OD600在O. 6 O. 8時加IPTG誘導，IPTG的終濃度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm誘導培養8h，再轉回37°C、200rpm進行發酵，發酵總時間39h。其他培養條件同無IPTG誘導的基因工程菌。設計原始菌coli MG1655的對照,種子培養基和發酵培養基中均不添加氨芐青霉素，其它培養條件與無IPTG誘導的基因工程菌相同。發酵結果基因工程菌在沒有IPTG誘導的條件下，能將140 g/L葡萄糖轉化得到55g/L的iR，R)~2, 3- 丁二醇。基因工程菌在有IPTG誘導的條件下，僅耗糖29g/L，生成{R,奶_2，3-丁二醇8. lg/L。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測到^ 7 )-2，3-丁二醇生成。通過上述發酵過程可以發現，雖然IPTG誘導后基因工程菌表達了大量的目的蛋白，但是發酵液中目的產物{R，奶_2，3-丁二醇的濃度卻不高；沒有IPTG誘導的基因工程菌表達的目的蛋白量雖然少，但是發酵液中卻有高濃度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。其原因可能是基因工程菌不加IPTG誘導的本底表達就可滿足細菌代謝及iR，R)~2, 3-丁二醇的大量合成；而添加IPTG后，蛋白大量表達可能引起無活性的包涵體生成，使得2，3-丁二醇途徑活性大量降低，同時IPTG對細胞也有毒害作用。
權利要求
1.產(疋/ )-2，3- 丁二醇的基因工程菌，是將budB基因、budA基因和ydjL基因通過表達載體導入宿主菌得到的重組菌。
2.根據權利要求I所述產{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌 i^scherichia coif) MG1655。
3.根據權利要求2所述產{R，/ )-2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述表達載體為pTrc99a。
4.一種構建權利要求1-3所述產^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步驟 (1)從肺炎克雷伯氏桿菌{Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分別擴增Zwt/i 基因和ZwW基因，從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) 168中擴增_7心1基因； (2)利用重疊延伸PCR技術將budB基因、budA基因和基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因； (3)將所述融合基因插入表達載體的多克隆位點處，得到重組質粒； (4)將所述重組質粒導入宿主內即得所述產{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。
5.根據權利要求4所述構建產{R，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步驟(I)中用于擴增budB基因的引物為PI和P2 ;用于擴增budA基因的引物為P5和P6 ;用于擴增基因的引物為P9和PlO ； 所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分別為Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。
6.根據權利要求5所述構建產iR，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步驟(2)的具體方法為 (I)將步驟(I)所得too 基因與pMD 18-simp Ie-T載體相連獲得重組質粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4為引物擴增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ； (II)將況/說基因與載體pMD18-simp Ie-T相連,獲得重組質粒pMD18-simple-T-/w￡/y4,以P7和P8為引物擴增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；(III)將ydjL 基因與載體 pMD 18-simp Ie-T 相連,獲得重組質粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12為引物擴增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進行擴增，獲得擴增產物I ;以所述擴增產物I為模板，以P7及P12為引物擴增獲得ZwW基因與_7心1基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ； 認budA基因與基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進行擴增，獲得擴增產物2 ;以擴增產物2為模板，P13及P14為引物，進行擴增，獲得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’， P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。
7.—種權利要求1-3所述基因工程菌在制備{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的應用，其特征在于將基因工程菌接種至發酵培養基，在搖床轉速18(T220r/min、35_38°C條件下發酵30 48h，收獲含有{R，R) _2，3- 丁二醇的發酵液； 所述發酵培養基為葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏3 7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨芐青霉素20 50呢/mL，溶劑為水。
全文摘要
本發明公開了一株產(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法和應用，屬于基因工程領域。所述基因工程菌，是將budB基因、budA基因和ydjL基因通過表達載體pTrc99a轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)MG1655得到的基因工程菌。本發明的菌株能夠在不需要添加誘導劑的情況下，高產高純度的(R,R)-2,3-丁二醇，同時細胞生長良好，底物消耗迅速，發酵周期較短，成本低。該工程菌的獲得對生物制造(R,R)-2,3-丁二醇具有重要的工業應用價值。
文檔編號C12N1/21GK102965324SQ20121050552
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者黃和, 紀曉俊, 沈夢秋, 聶志奎, 夏志芳 申請人:南京工業大學