專利名稱：人類羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種將人類羊膜上皮細胞體外同絲素蛋白支架構建復合體的方法。
背景技術：
中樞神經系統(central nervous system, CNS)損傷后的治療和功能重建仍是當今生物醫學界一大難題，傳統觀念認為，損傷后神經元以及軸突幾乎無自發再生能力，從而阻礙了 CNS的自身修復功能。Aguayo等在20世紀80年代研究發現，CNS軸突是可以再生的，只是中樞神經微環境不利于其再生，因此必須進行有效的外部干預來激發殘留的神經元或進行細胞移植替代，誘導受損神經軸突再生，恢復神經沖動在損傷部位的傳遞，最終達到功能恢復。以往研究者利用羊膜組織對損傷的神經進行物理性“橋接”使其能夠繼續生長修復，近年來，研究發現AECs許多新特征，其中尤以AECs對神經系統的作用最為引人矚目其與神經組織良好的整合性，分泌神經營養因子及免疫耐受性使得AECs在治療CNS疾病中得到了很好的應用。AECs移植修復CNS損傷的策略主要包括補充失去的神經元以及改善損傷部位微環境兩個方面。AECs可 填充損傷部位充當細胞橋，引導再生性出芽，同時抑制膠質細胞的過度增生，其自分泌神經營養因子可以改善損傷部位的微環境，進一步刺激殘存神經元與軸突的再生。蠶絲由絲素和絲膠兩種蛋白組成，用胰酶去除絲膠后可制成為絲素蛋白支架。絲素蛋白是一種具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質材料，具有理想的三維空間構型，為細胞的停泊、生長、繁衍、新陳代謝、新組織形成提供支持。該支架的降解產物不對細胞繁殖產生不利的影響；其降解速度與細胞的增殖速度相匹配；具有一定的柔韌性，使之既能同機體組織緊密貼合，又不會對機體組織造成機械損傷等。近年來，絲素蛋白這種天然高分子纖維蛋白已廣泛應用于組織工程研究。本研究將羊膜細胞同絲素蛋白構建成復合體的體外細胞培養體系，觀察細 胞生長增殖過程，為組織工程最終應用于臨床提供前期準備。

發明內容
本發明應用體外細胞培養技術構建羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體。具體的方法步驟包括S1:羊膜上皮細胞的分離培養取乙肝表面抗原及HIV抗體檢測均陰性的孕婦剖宮產手術后獲取的羊膜，大小約15X15cm，分離、去除殘存的絨毛膜，PBS反復沖洗，直到洗盡血性液，將羊膜剪碎成直徑約l_2mm左右的小碎片，倒入有蓋玻璃皿中，分別加入O. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分鐘，用PBS液IOOml稀釋后經200目濾網過濾，同時在濾液中加入含5%FBS培養液終止消化，IOOOrpm離心6min收集細胞，接種在含10%FBS的RPMI1640的培養皿中，于37°C含5%C02的培養箱內培養。
S2 :原代細胞的純化對原代細胞分離培養至7天后進行純化，(I)在培養液中加Λ Ara-C,作用濃度為10_6mol/L，作用時間為36h。(2)更換新鮮培養基繼續培養Id。(3)再次向培養皿中加入Ara-C，作用濃度為10_7mol/L，作用時間為12h。(4)更換新鮮培養基繼續培養Id。(5)棄培養基，D-Hank清洗細胞2次，O. 25%胰酶消化5min，FCS終止消化，800R/min離心5min，棄上清后全培養基繼續培養。S3 :原代細胞的鑒定取上述純化后的細胞繼續培養3d后，用胰酶消化，PBS液調整細胞濃度為lX106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4° C孵育30min，PBS洗2遍，直接進行流式細胞儀分析。S4 :羊膜細胞絲素蛋白支架復合體的構建將上述體外培養并經過純化后的羊膜上皮細胞調整濃度為I X 106/ml，將細胞懸液滴在滅菌處理過的絲素蛋白支架上，放入24孔培養板中懸空孵育4小時，待細胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI 1640全培養基，令細胞完全浸沒，2到3天半量換液，每天進行倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長情況。S5 :掃描電鏡觀察第十天取出支架復合物標本放入2. 5%戊二醛固定，PBS沖洗后，常規脫水，臨界點干燥噴金在掃描電鏡下觀察細胞的生長情況。本發明將具有多分化潛能的羊膜上皮細胞同具有著良好生物相容性和生物降解性的絲素蛋白支架構建復合體，這種空間立體化培養的結果是明顯促進了細胞的增殖、分泌，該發明為組織工程學應用于中樞神經系統損傷的修復作好了準備。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的體外構建人類羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的方法步驟流程圖。
具體實施例方式主要實驗儀器倒置相差顯微鏡CK-40型(日本Olympus)、熒光顯微鏡BX-51型(日本Olympus)、數字成像系統DP-50 (日本01ympus)、C02培養箱(SPXCorporation)、流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司)、離心機TDL-5 (上海安產科學儀器廠)、恒溫冷凍切片機CM1900型(德國Leica)、培養皿、培養板(美國Corning公司)、超凈工作臺(蘇州蘇凈安泰公司)、深低溫冰箱 MDF-382E (SANYO Corporation)、紫外分光光度計(北京歐普特)。主要材料試劑RPMI1640(Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，青霉素、鏈霉素(Gibco/BRL),EDTA(Sigma)，焦油紫(上海凱試科技)，PE或FITC標記的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、⑶49d、HLA-DR單克隆抗體(美國BD公司)，N2輔助因子(上海索萊寶公司)，bFGF、EGF (上海欣百諾生物科技公司)，L-Glutamine (美國Invitrogen), mIGF (以色列ProSpec-Tany公司)，甲狀腺素(美國Magical Scientifi c，LLC. )，RT-PCR試劑盒和Galc、MBP檢測試劑盒(Promega 公司)，Trizol 試劑(美國 Invitrogen),鼠抗人 GFAP IgG 單抗(Santa Cruz), 抗人MAP IgG單抗(Transduction Laboratories),鼠抗人NFIgG單抗(Sigma),鼠抗人GalcIgG單抗(Sigma),鼠抗人MBP IgG單抗(Cymbus), ant1-neuN (北京博奧森生物技術)，絲素蛋白支架(由蘇州大學材料工程學院提供)，H0echst33342 (Sigma公司)，HRP(Boster),TMB 顯示劑(AMRESC0 分裝)，鼠抗人 Vimentin IgG 單抗(Santa Cruz)，鼠抗人 CK19 IgG 單抗(上海信然生物)。所述人類羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體構建的方法包括如下步驟S1:羊膜上皮細胞的分離培養取乙肝表面抗原及HIV抗體檢測均陰性的孕婦剖宮產手術后獲取的羊膜，大小約15X15cm，分離、去除殘存的絨毛膜，PBS反復沖洗，直到洗盡血性液，將羊膜剪碎成直徑約l_2mm左右的小碎片，倒入有蓋玻璃皿中，分別加入O. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分鐘，用PBS液IOOml稀釋后經200目濾網過濾，同時在濾液中加入含5%FBS培養液終止消化，IOOOrpm離心6min收集細胞，接種在含10%FBS的RPMI1640的培養皿中，于37°C含5%C02的培養箱內培養。S2 :原代細胞的純化對原代細胞分離培養至7天后進行純化，(I)在培養液中加Λ Ara-C,作用濃度為10_6mol/L，作用時間為36h。(2)更換新鮮培養基繼續培養Id。(3)再次向培養皿中加入Ara-C，作用濃度為10_7mol/L，作用時間為12h。(4)更換新鮮培養基繼續培養Id。(5)棄培養基，D-Hank清洗細胞2次，O. 25%胰酶消化5min，FCS終止消化，800R/min離心5min，棄上清后全培養基繼續培養。S3 :原代細胞的鑒定取上述純化后的細胞繼續培養3d后，用胰酶消化，PBS液調整細胞濃度為lX106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4° C孵育30min，PBS洗2遍，直接進行流式細胞儀分析。S4 :羊膜細胞絲素蛋白支架復合體的構建將上述體外培養并經過純化后的羊膜上皮細胞調整濃度為I X 106/ml，將細胞懸液滴在滅菌處理過的絲素蛋白支架上，放入24孔培養板中懸空孵育4小時，待細胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI 1640全培養基，令細胞完全浸沒， 2到3天半量換液，每天進行倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長情況。S5 :掃描電鏡觀察第十天取出支架復合物標本放入2. 5%戊二醛固定，PBS沖洗后，常規脫水，臨界點干燥噴金在掃描電鏡下觀察細胞的生長情況。實驗結果及分析如下1.原代細胞焦油紫染色結果顯示，從形態學分析，細胞有較大胞核，核仁明顯，胞體多為圓形或多邊形，貼壁培養的細胞相互聯接，FCM檢測的AECs同樣表達⑶29、⑶44、⑶71，各自的表達率分別為95. 44%，18. 32%和15. 11%，而不表達造血細胞的表面標志⑶34和⑶45,HLA-DR亦為陰性；同時其不表達⑶49d。免疫熒光染色結果顯示，羊膜上皮細胞同時表達間充質細胞標志波形蛋白和上皮細胞標志CK19。(圖2)2.使用倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察種植在支架上的細胞，1-2天細胞即完全貼壁，培養3-5天時細胞生長增殖活躍，細胞伸出細長突起，沿支架不斷向前遷移延伸，漸漸相連成片分布在支架網眼內。一周時支架網眼充滿細胞，掃描電鏡見細胞伸出尾足與支架緊密貼附，適度伸展，形態多樣，從胞體伸出2-5個突起，相鄰細胞突起首尾相接或連成細胞鏈，平行或纏繞于支架上，有些細胞鏈懸空架在連根蠶絲之間，在某些胞體上和支架上可見基質樣分泌物。2周左右三維支架開始崩解，細胞包埋，形成片狀、有一定彈性的羊膜細胞-絲素蛋白復合體，此時AECs在支架上的形態同平面培養比較，進行掃描電鏡觀察可發現細胞形態較平面培養圓潤，細胞間可見偽足伸出，表面微絨毛豐富。(圖3)本項發明涉及組織工程技術修復CNS損傷領域，組織工程一詞最早由1987年美國科學基金會提出，具體來說，組織工程是將組織細胞粘附在一種生物相容性良好、并可在人體內逐步被降解吸收的支架材料上，并提供營養使之擴增，在體外形成細胞-生物材料復合物，然后將這種復合物植入機體內，在支架材料逐步被人體吸收的同時,細胞不斷增殖并分泌基質，最終形成具有與原來特殊功能和形態相應的組織器官，從而達到修復創傷和重建功能的目的。絲素蛋白是蠶絲中的主要成分，它以反平行折疊鏈構象件為基礎，形成直徑約IOnm的微纖維，無數微纖維組成直徑大約I μ m的細纖維再沿縱軸排列成直徑10-18 μ m的單纖維即絲素蛋白纖維，研究證明該纖維不會引起T細胞調節的體內應答，可以支持細胞粘附、分化和組織形成，對細胞具有良好的吸附作用，并能維持正常形態和功能，是立體培養的天然支架。細胞只有在立體環境中培養才能保證正常形態及功能，選擇合適生物材料作為生長和三維支架是組織工程研究的重點。Dal等將三維網膜絲素蛋白支架植入大鼠皮下6個月后，被上皮、血管等新生組織填充，伴隨少量巨噬細胞和極個別多核巨細胞，但無T細胞免疫反應發生，也無纖維化生成。通過免疫組化證實有血管內皮細胞特異表達產物、血管性假血友病因子存在，顯示其具有良好的生物相容性以及引導了網狀連接組織生成，同時有血管生成，保證了網狀連接組織的生存和持久力。本研究構建的羊膜細胞與絲素蛋白復合體，無論在體外實驗抑或動物體內實驗中均體現了細胞在材料表面具有足夠的吸附能力，材料具備的良好生物相容性基本保證了細胞在材料孔徑之間的立體化生長，更加符合其生理化生存需求。再加上具備一定的力學強度，支持了細胞的分化增殖。支架材料為CNS提供了更為有利的再生環境。實驗同時證實了絲素蛋白支架能以適當的生物降解速率進行降解，在新生組織再生的同時可逐步被吸收和降解直至消失，這一特性也是理想的組織工程支架材料所必需的。

本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1.一種在體外構建羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的方法，其包括如下步驟51:羊膜上皮細胞的分離培養取乙肝表面抗原及HIV抗體檢測均陰性的孕婦剖宮產手術后獲取的羊膜，大小約15X15cm，分離、去除殘存的絨毛膜，PBS反復沖洗，直到洗盡血性液，將羊膜剪碎成直徑約1-2_左右的小碎片，倒入有蓋玻璃皿中，分別加入0. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分鐘，用PBS液100ml稀釋后經200目濾網過濾，同時在濾液中加入含5%FBS培養液終止消化，1000rpm離心6min收集細胞，接種在含10%FBS的 RPMI1640的培養皿中，于37°C含5%C02的培養箱內培養。52:原代細胞的純化對原代細胞分離培養至7天后進行純化，(I)在培養液中加入 Ara-C,作用濃度為10_6mol/L，作用時間為36h。(2)更換新鮮培養基繼續培養Id。(3)再次向培養皿中加入Ara-C，作用濃度為10_7mol/L，作用時間為12h。(4)更換新鮮培養基繼續培養Id。(5)棄培養基，D-Hank清洗細胞2次，0. 25%胰酶消化5min，FCS終止消化，800R/ min離心5min,棄上清后全培養基繼續培養。53:原代細胞的鑒定取上述純化后的細胞繼續培養3d后，用胰酶消化，PBS液調整細胞濃度為IX 106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、 CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE,置 4。C 孵育 30min, PBS洗2遍，直接進行流式細胞儀分析。54:羊膜細胞絲素蛋白支架復合體的構建將上述體外培養并經過純化后的羊膜上皮細胞調整濃度為IX 106/ml，將細胞懸液滴在滅菌處理過的絲素蛋白支架上，放入24孔培養板中懸空孵育4小時，待細胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI1640全培養基，令細胞完全浸沒，2到3天半量換液，每天進行倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長情況。55:掃描電鏡觀察第十天取出支架復合物標本放入2. 5%戊二醛固定，PBS沖洗后，常規脫水，臨界點干燥噴金在掃描電鏡下觀察細胞的生長情況。
2.如權利要求1所述的體外構建羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的方法，其中所述步驟3為明確原代細胞的性質，除了對純化后的細胞進行流式細胞儀檢測，同時取少量細胞進行特異性細胞表面標記物免疫熒光染色測定及應用焦油紫染色觀察細胞形態。
3.如權利要求1所述的體外構建羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的方法，其中所述步驟4所用的絲素蛋白支架系蘇州大學材料學院提供，絲素蛋白來源于蠶絲，是一種具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質材料，具有理想的三維空間構型，為細胞的停泊、生長、繁衍、新陳代謝、新組織的形成提供支持。該支架的降解產物不對細胞繁殖產生不利影響，其降解速度與細胞的增殖速度相匹配，并具有一定的柔韌性，使之既能通機體組織合并貼合，又不會對機體組織造成機械損傷。
全文摘要
本發明提出一種在體外構建羊膜上皮細胞與絲素蛋白支架復合體的方法，其步驟包括羊膜上皮細胞的分離培養；原代細胞的純化；原代細胞的鑒定；羊膜細胞接種到絲素蛋白支架上進行空間培養；掃描電鏡觀察結果。本發明的體外將羊膜細胞同絲素蛋白支架構建復合體的方法，先采用人類剖宮產后廢棄的羊膜作為材料，獲取羊膜上皮細胞進行體外培養，并在一定條件下進行細胞純化，將純化后的細胞同絲素蛋白支架構建組織工程材料，為細胞營造良好的空間生長環境，這項發明為不久的將來臨床應用羊膜來源的細胞移植治療中樞神經系統各種創傷性疾病的功能修復提供了新的思路。
文檔編號C12N5/073GK103045535SQ20121050553
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月2日 優先權日2012年12月2日
發明者徐杰, 房文峰, 朱愛華 申請人:吳衛江