專利名稱：糖尿病病理演變前期SFRP4基因的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與糖尿病病理演變mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
2011年統計的最新數據顯示全國已經確診的糖尿病有9240萬，糖尿病前期的人群有I. 48億。糖尿病并發癥是一種常見的慢性并發癥，是由糖尿病病變轉變而來，后果相當嚴重，如足病(足部壞疽、截肢)、腎病(腎功能衰竭、尿毒癥)、眼病(模糊不清、失明)、腦病(腦血管病變)、心臟病、皮膚病、性病等是糖尿病最常見的并發癥，是導致糖尿病患者死亡的主要因素。糖尿病的病理生理變化是由于胰島素分泌不足和組織糖利用障礙，導致血糖過高代謝障礙。糖尿病有原發性與繼發性兩種。原發性病因尚未清楚；，可能與遺傳等因素有關，繼發性見于慢性胰腺炎、癌癥、血色病、胰大部分手術切除、腦垂體前葉機能亢進、促腎上腺皮質機能亢進、腎上腺嗜鉻細胞瘤、胰島α細胞瘤、妊娠糖尿病等。近來科學家們都把糖尿病的發病機制的放在基因病理生理學水平進行深入研究，發現了一些與糖尿病發病有關一些基因，如SFRP4基因是近來發現，SFRP4是在機體炎癥過程中起作用的分子，這是人們首次將其與二型糖尿病患病風險聯系起來，SFRP4基因屬編碼分泌型卷曲相關蛋白
4。SFRP4的表達與炎癥標志物，其胰島釋放白細胞介素-I β刺激。全身SFRP4升高引起糖耐量降低，通過減少胰島細胞表達的Ca (2 +)通道，并抑制胰島素胞吐作用，SFRP4從而提供了胰島炎癥和胰島素分泌受損之間的聯系。此外，增加血清中的蛋白質被從T2D患者幾年前診斷，這表明SFRP4 T2D胰島功能障礙可能是一個潛在的生物標志物。研究人員對糖尿病患者與非糖尿病患者的beta細胞(負責生產胰島素的細胞)進行了比較，發現SFRP4蛋白在糖尿病患者體內的水平明顯較高，發現血液中SFRP4蛋白水平高于平均值的人，在未來幾年患糖尿病的可能性比SFRP4低于平均水平的人高五倍。這也是首次證明beta細胞中的炎癥與糖尿病有關，研究人員指出慢性低度炎癥削弱了 beta細胞，使它們不再能夠生產足量的胰島素。無疑，有多種因素參與了這一削弱過程，而SFRP4蛋白就是其中之一。研究人員每隔三年對上述非糖尿病患者血液中的SFRP4蛋白水平進行檢測，這樣的檢測總共進行了三次。研究顯示，血液中SFRP4高于平均水平的人中有37%在研究期間患上了糖尿病。而那些血液中SFRP4低于平均水平的人中，只有9%在研究期間患糖尿病。表明SFRP4蛋白可作為糖尿病的有力風險指標，有望將診斷時間提前數年。研究人員還解析了 SFRP4損害胰島素分泌的機制，指出SFRP4水平升高會減少鈣離子通道在胰島的表達并抑制胰島素分泌，導致葡萄糖耐量減低。該蛋白標志不僅能指示糖尿病的患病風險，還能夠反映疾病的進程。研究顯示，這一指標獨立于其他已知二型糖尿病風險因子，例如肥胖和年齡等等。研究人員認為這一指標可以通過簡單的血液測試，指示正常體重的中年人患糖尿病的風險。這將給他們更強的動力來盡早改善生活方式，以預防糖尿病。此外，該研究也有助于人們開發治療二型糖尿病的新方法，即阻斷beta細胞中的SFRP4蛋白以減少炎癥從而保護細胞。臨床上當患者被確診為二型糖尿病時，往往這一疾病早已在患者體內發展了多年，而且已經對血管和眼部造成了傷害，及早篩查出糖尿病的早期風險是很有價值的，這樣人們就可以盡早采取預防性療法。本發明人在長期研究中發現，導致重大疾病死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診治。因此，開發出用于糖尿病發病前期的相關基因水平篩查試劑盒有非常大的臨床價值。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷糖尿病、治療糖尿病、以及預防糖尿病，已 取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物mRNA水平上做更精確的早期篩查和診斷，在糖尿病前期做預測和篩查，這樣就能將糖尿病的發病率降下來，可以大大降低社會成本，進一步提高國民的健康體質。發明人在研究中發現用雙標記技術，同步檢測蛋白質與檢測mRNA,有時候mRNA有表達，但蛋白質有時候沒有轉錄出來，它們有時候存在表達時空不對應現象，才檢測mRNA更準確。本發明人在研究中發現SFRP4基因在糖尿病患者、高危人群、正常對照人有明顯的表達量變化，將SFRP4作為篩查糖尿病病變前期有非常重要的臨床意義。發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現在治已病(發病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，發明人在開發和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創新。特別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與病理組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發病變前期的mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要mRNA靶標，將臨床上疾病形成后診治模式變成重大疾病的預防性診治，爭取了疾病診治的時間和空間，達到預防疾病。根據現有的文獻資料采用原位雜交技術和組化免疫方法檢測SFRP4基因mRNA水平表達量的檢測技術及試劑盒未見報道。本發明人在針對創新性發明的要求，設計了(糖尿病患者、高危人群、正常對照)不同數據例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上糖尿病病人高表達，高危人群有不同程度表達10-20%，正常對照都是不表達。表明SFRP4基因是糖尿病病變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響。
鑒于目前臨床上人類重大疾病診斷大部分是晚期，治療也是晚期，導致死亡率不降的診治模式。本發明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到重大疾病預防性診治目的，在理念和技術做出了創新性的突破，提供疾病變化mRNA水平篩查技術，使臨床上有了一項新的疾病變化前期mRNA水平篩查的技術，為臨床重大疾病的診治爭取時間和空間，實現重大的預防。綜上所述，本發明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發明還要提供上述試劑盒用于與糖尿病前期篩查及早期預警相關的原位雜交檢測方法。

發明內容
為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下
本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針序列為序列表SEQ ID NO. I所示序列，是SFRP4基因CDS中一段序列，420bp，SFRP4基因為序列表SEQ ID NO. 2所示序列，位于染色體7pl4. 1〃上。本發明試劑盒的一個優選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括雜交液。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括顯色劑。本發明的糖尿病病變前期SFRP4篩查試劑盒應用價值在于，對糖尿病前期篩查及預警有非常重要臨床意義，進一步配合臨床做預防性治療。本發明還提供一種SFRP4基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2)檢測所述雜交復合體。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血液細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自糖尿病患者、高危人群、健康正常人群。
本發明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以SFRP4為檢測對象，合成探針是SFRP4基因CDS中一段序列，429bp，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供SFRP4的半定量或定量表達程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達量，正常人SFRP4基因不表達，即無顯色，在糖尿病病人高度表達，大量染色，高危人群有輕度染色。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發明的一個優選實施例的方案是以SFRP4合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的RNA的表達量。本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的SFRP4表達量，用來確定糖尿病病理演變前期的mRNA變化量，預警糖尿病基因病理生理學變化。因為SFRP4在正常人中不表達，在糖尿病患者高表達，如果高危人群有表達表明有發生糖尿病的風險，及時進行(介入)預防性治療。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發明具有如下有益效果
本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測糖尿病發生的風險。在生化指標未產生異常之前，及早做到以上基因mRNA表達異常的信息采集，給臨床醫生一個真正的早期預警和預防性治療參考和指導。此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。


圖I是本發明SFRP4基因原位雜交技術流程圖。圖2是本發明實施例中糖尿病病人SFRP4表達圖片。圖3是本發明實施例中輕度血糖升高的高危人群圖片。
圖4是本發明實施例中正常人SFRP4表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發明的保護范圍。實施例I
按照常規方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以SFRP4基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中 本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
消化液_100 μ L/管 I管/盒無色透明液體_
保護液ToouL/管 I管/盒無色透明液體
預雜交液_ 1300 μ L/管 2管/盒無色透明液體_
正義雜交液_10uL/管 ^ I管/盒免爸透明液體
反義雜交液_10 μ L/管_I管/盒無色透明液體_
封閉液_ 1000 μ L/管 I管/盒無色透明液體_
堿性磷酸酶抗體 Γμ L/管I管/盒無色透明液體
顯色劑A 75μ 7管_I管/盒黃色液體-
顯色劑Bj~20uL/管 I管/盒無色透明液體
緩沖液I_90mL/瓶I瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II_80mL/瓶I瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III^OmL/瓶 ^ 3瓶/盒孩黃色或無色透明液體
緩沖液IVbOmL/瓶 ^ I瓶/盒逐黃色或無色透明液體
固定液_90mL/瓶_I瓶/盒無色透明液體_
陽性對照標本|6片/盒
配制試劑使用濃度
1).將IOX緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液I;
2).將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II；
按1:100稀釋成O. 2 X緩沖液II ;按1:200稀釋成O. IX緩沖液II ；
3).將IOX緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液III；
4).IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各IOmL,加水至IOOmL既可)ο實施例2
應用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本SFRP4基因表達量的實施過程
1).取待測標本兩張；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加IX緩沖液I 99. 9ml,即為使用濃度)50ml，37°C水浴預熱lOmin，放進16張玻片，37°C處理12 min,再用IX緩沖液I洗5min ；
3).用0.2%的保護液(保護液Iml加I X緩沖液I，99ml即為使用濃度)洗lOmin，
三蒸水洗5min (以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片，讓其自然干燥；
4).將玻片放入保濕盒內，加預雜交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上；
5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；6).將玻片放入保濕盒內，一張加正義雜交液25μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內
在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ；在42°C恒溫水浴箱中用O. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ；
在42°C恒溫水浴箱中用O. IX緩沖液II洗兩次，每次15min ；
8).用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·將玻片放入保濕盒內，加O. 5%封閉液(Iml封閉液加5ml I X緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；
10).取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11).將玻片放入保濕盒內，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入I.8mlIX緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產生假陽性(此步驟不需加蓋玻片)；
12).取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min；
13).用IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到30mL IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針，將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的RNA的表達量。糖尿病病人20名，高危人群(輕度血糖升高人)20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有糖尿病患者SFRP4基因mRNA表達量高，細胞染色深；高危人群表達稍降低，小數染色；正常對照組SFRP4基因不表達，細胞不染色，具體結果見圖2、圖3、圖4。
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所示序列。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種SFRP4基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液細胞標本。
9.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液細胞標本選自糖尿病患者、聞危人群、正常人標本。
10.SFRP4基因在制備檢測糖尿病原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與糖尿病病理演變前期密切相關的SFRP4基因mRNA的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測SFRP4基因表達量，比現有的臨床生化檢測指標更早期，能實現真正的糖尿病病理演變前期mRNA水平篩查，做到糖尿病的預防性診治，將糖尿病消滅在萌芽狀態。同時，本發明的檢測方法簡單方便，成本低,便于醫院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102965448SQ20121053415
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者張玉麗, 裘建英, 張云福, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司