專利名稱：分泌samhd1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株、由該細胞株分泌的單克隆抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體及應用，特別涉及一株能夠穩定分泌抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，及其分泌產生的單克隆抗體及應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
SAMHDl蛋白是一種鼠Y干擾素誘導基因Mgll的類似物，最近被鑒定為人免疫缺陷病毒(HIV-1)的限制性因子，具有脫氧核苷三磷酸水解酶的功能，在樹突狀細胞和其他髓系細胞中能阻礙病毒的早期復制，是慢病毒蛋白Vpx的靶目標，其能解除HIV-1的感染限制作用。SAMHDl同時也與AGS綜合征相關，SAMHDl的突變能引起AGS，AGS為一種炎性腦病，以慢性腦脊髓炎流質淋巴細胞增多癥為特點，能增高抗病毒因子IFN-a的水平。有研究發現，HIV-2和相關的免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)能夠通過使用它們編碼的Vpx蛋白來降解SAMHD1，從而越過骨髓細胞內的保護機制，使人感染病毒。SAMHDl基因組全長約1878kb，它是巨噬細胞里的一個酶蛋白，有研究發現SAMHDl降解了巨噬細胞內的大部分脫氧核苷酸，而脫氧核苷酸是病毒復制所需的必要原料，從而抑制了病毒的反轉錄和病毒cDNA的形成，使髓系細胞不感染HIV。如果我們能阻止艾滋病毒在這些細胞內的復制，就可以抑制艾滋病在其他細胞內的復制，這樣就能夠防止艾滋病的發生。本研究構建了 SAMHDl基因的重組質粒，表達并純化出了具有很好反應原性的可溶性融合蛋白，對于SAMHDl單克隆抗體的制備及其磷酸水解酶實驗提供了基礎材料。

發明內容
本發明以人血漿中淋巴細胞提取的RNA為基礎，通過RT-PCR方法，擴增出SAMHDl基因并克隆至PMD-18T載體。測序鑒定正確后，通過雙酶切將SAMHDl基因亞克隆至原核表達載體pET-30a，構建重組質粒pET30a-SAMHDl并轉化Rosetta(DE3)。通過對表達條件的優化，最終獲得分子質量約79kDa、可溶性形式的重組蛋白SAMHD1，并采用鎳柱對該蛋白進行純化。Western blot檢測結果表明，純化的SAMHDl蛋白能與Abcam公司的SAMHDl抗體發生特異性反應，表明其具有良好的抗原性。將純化的人SAMHDl作為免疫原，腹腔接種4周齡BALB/c小鼠。按照常規雜交瘤細胞融合技術將免疫小鼠脾細胞與SP2/0融合。用鎳柱純化的SAMHDl為篩選抗原，建立間接ELISA方法，篩選出針對SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細胞，最終獲得一株能夠穩定分泌SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3C3，分類命名為抗人SAMHDl單克隆抗體3C3雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6709，保藏日期為2012年10月29日。
Western blot和間接免疫突光結果表明此株雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體能特異性識別真核表達的人重組蛋白SAMHD1，而與His標簽蛋白以及馬、猴真核表達的重組蛋白SAMHDl均不發生反應。因此，進一步的本發明還提出了由所述的雜交瘤細胞株分泌的抗人SAMHDl蛋白的單克隆抗體，及所述的單克隆抗體在制備檢測人SAMHDl蛋白試劑中的應用。


圖1為PCR擴增結果；M DL2000DNA Marker ；1.目的片段的PCR產物；2.陰性對照。圖2為重組質粒pET30a_SAMHDl的雙酶切鑒定；

M I DL2000DNA Marker ；2. pET30a — SAMHDl 的 BamH I 和 Not I 酶切結果；M2 DL15000DNA Marker ；圖3為重組蛋白的SDS-PAGE分析；M、蛋白質Marker ;1、經IPTG誘導表達17h的全菌；2、裂解后的上清；3、裂解后的沉淀；圖4為純化重組蛋白的SDS-PAGE分析；M、蛋白質Marker ;1、純化后的上清；圖5為重組蛋白SAMHDl的western-blot分析；M :蛋白質Marker ；1 :純化后的重組蛋白；2 pET32a/Rosetta(0E3)對照圖6 為 MAb 的 western blot 鑒定；Μ、蛋白質 Markerl、SAMHDl 的真核表達蛋白 2、pET30a/Rosetta(0Ε3)對照；圖7為MAb的間接免疫熒光鑒定結果；1、3C3 ;2、Negative control :SP2/0 上清。圖8為MAb的特異性分析。M、蛋白質Marker ;1、人SAMHDl的真核表達蛋白；2、猴SAMHDl的真核表達蛋白；3、馬SAMHDl的真核表達蛋白；4、293T細胞空白對照；5、馬皮細胞；6、兔腎細胞。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的制備及單抗特異性分析I材料與方法1.1菌株、載體ΗΒ101感受態細胞、Rosetta(DE3)、克隆載體pMD18-T、表達載體pET30a(+)(哈爾濱獸醫研究所馬病研究組保存)。1. 2主要試劑RNA提取試劑盒、膠回收(小量)試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；質粒提取試劑盒，購自OMEGA公司；DL — 15000、DL — 2000Marker、低分子質量蛋白質標準、限制性內切酶(BamH1、Not I)、Ex Taq 酶、dNTP mixture、T4DNA 連接酶、異丙基一β — D —硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨芐西林、卡那霉素(kan)，均購自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗鼠二抗(IRD-1gG)，SAMHDl抗體購自Abcam公司。SAMHDl和骨髓瘤細胞SP2/0由本發明發明人所在實驗室保存；BALB/C小鼠購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。HAT選擇性培養基、HT選擇性培養基、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、IRD標記的羊抗鼠IgG(IRD-1gG)、羊抗鼠熒光二抗(FITC-1gG)、PEG-4000均購自Sigma公司；DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Hi TrapProteinG HP購自GE公司。SBAClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購于Southern Biotechnology公司。1. 3引物的設計與合成根據GenBank上發表的SAMHDl基因序列設計一對引物，上游引物引入BamHI酶切位點，下游引物引入Not I酶切位點(下劃線部分)。上游引物Homo BamHlsqSAMHDlF :5’ 一CCA AGGATCCAT GCAGCGAGCCGATTCC — 3’ ；下游引物 Homo. Notl. sqSAMHDl. R :5’ — CCAAGCGGCCGCCATTGGGTCATCTTTAAAAAGC 一 3’。引物由上海博士生物工程技術服務有限公司合成。1. 4目的基因的RT-PCR擴增采人血20ml，加入肝素鈉抗凝，用O. OlM的PBS按1:1的比例稀釋，將其加入預先裝有15ml淋巴細胞分離液的離心管內，采用梯度離心法以IOOOg的轉速分離單個核細胞，將中層的單個核細胞按照小量RNA抽提試劑盒說明提取RNA，并反轉錄合成cDNA。以其為模板，擴增 SAMHDl 基因片段(95°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C1. 5min30s，30 個循環后，72°C延伸lOmin)。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1. 5原核表達載體PET-SAMHD1的構建與鑒定將SAMHDl基因的PCR產物膠回收后克隆入pET_30a ( + )載體，轉化HBlOl感受態細胞，可疑菌落經PCR和雙酶切鑒定正確后送往Invitrogen公司測序。測序正確的陽性質粒與pET-30a ( + )載體分別用BamHI + NotI雙酶切，再經膠回收、T4DNA連接酶連接、連接產物轉化Rosetta感受態。挑取可疑陽性菌落，經PCR、酶切及測序鑒定后，抽提陽性質粒，將其命名為pET30a-SAMHDl。1. 6SAMHD1基因的原核表達的最優表達條件摸索與SDS-PAGE分析將重組質粒pET30a_SAMHDl轉化表達感受態Rosetta (DE3)，挑取卡那抗性LB平板上的白色單菌落，接種于5ml含Kana +的LB培養液中37°C過夜培養。次日，將菌液按1:100比例接種于含K+的LB培養液中，37°C搖床振蕩培養至OD6tltlnm達到O. 4-0. 6時，進行如下條件的摸索以確定蛋白的最優表達條件。1. 6.1誘導溫度和時間的確定當轉化菌液的OD6tltlnm達到O. 4-0. 6時，加入終濃度為O. 2mM的IPTG，分別置于16°C、30°C和37°C搖床振蕩培養，培養時間分別為17h、8h和6h。取樣，4000rpm離心lOmin，棄上清，用原體積1/10的PBS重懸沉淀后超聲破碎。12000rpm離心20min，分別收集上清和沉淀，經SDS-PAGE進行重組蛋白SAMHDl可溶性分析。1. 6. 2IPTG誘導濃度的確定當轉化菌液的0D600nm達到O. 4-0. 6時，分別以終濃度O. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM和ImM的IPTG于16°C誘導表達16h。取樣，4000rpm離心IOmin,棄上清，同樣用原體積1/10的PBS重懸沉淀。進行SDS-PAGE電泳以確定IPTG的最佳誘導濃度。I · 7原核表達重組SAMHDI的純化根據N1-NTA His Bind Resin說明書進行蛋白樣品、N1-NTA柱處理及蛋白樣品的純化，蛋白純化的整個操作過程中過柱溶液均靠重力自然沉降。1. 8原核表達重組蛋白SAMHDl的抗原性鑒定將純化的SAMHDl做SDS-PAGE電泳后進行電轉印(15V電壓lh)。轉印后將硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的PBS封閉液4°C封閉過夜。PBST洗膜3遍，IOmin/次。以1:10000稀釋的Abcam的SAMHDl抗體作為一抗，室溫作用2h。PBST洗滌3次，再與1:10000倍稀釋的IRD標記的羊抗鼠-1gG為二抗室溫作用lh，PBST洗滌3次，用成像儀掃描記錄結
果O1. 9動物免疫SAMHDl蛋白經鎳柱純化后作為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑乳化，經腹腔接種4周齡BALB/C小鼠，100 μ g /只。以后每間隔2周將免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑乳化進行免疫，共免疫3次。在三免后第7 10天尾部靜脈采血測抗體效價，當抗體效價達到1:1O4以上時，用不加佐劑的抗原于腹腔加強免疫，IOOyg /只。按制備單抗的常規方法，3 d后取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。2. O間接ELISA檢測方法的建立以純化的SAMHDl原核表達蛋白作為包被抗原，采用棋盤滴定法建立檢測雜交瘤細胞的間接ELISA方法，通過 酶標儀讀取OD45tlnm值。取陽性孔OD45tol值接近1. O, P/N值最大的抗原、抗體稀釋度作為二者的最佳工作濃度。2.1細胞融合及雜交瘤細胞的篩選將免疫鼠的脾細胞與SP2/0用PEG4000進行融合，用建立的ELISA方法進行篩選。經4次亞克隆后，選擇D45tlnm值高且能穩定分泌抗體的細胞擴大培養。每次亞克隆前都要及時進行細胞凍存。2. 2MAb 的鑒定2. 2.1腹水的制備及效價的測定按照“2. O”中建立的間接ELISA方法對3C3雜交瘤細胞上清及腹水效價的測定，即將所得的細胞上清和腹水分別從1:20開始做一系列梯度稀釋，稀釋倍數為2。同時設置空白、標準陰、陽性血清對照。判定標準為陽性值接近1. O,陰性值小于O. 2，且檢測樣品值是陰性值的2.1倍，此時的最大稀釋倍數為腹水和雜交瘤上清的ELISA效價。2. 2. 2MAb免疫球蛋白亞類鑒定利用SBA Clono-typing TM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒對MAb進行亞類鑒定。2. 2. 3MAb 的 western blot 鑒定將SAMHD1-PCDNA3.1重組質粒轉染293T細胞，37°C培養48小時后收集細胞并將其裂解，裂解物經SDS-PAGE轉印硝酸纖維素膜，用純化的濃度為lmg/ml的SAMHDl抗體按
I 10000稀釋作為一抗，羊抗鼠IRD-1gG作為二抗(I 10000)，進行western blot分析。2. 2. 4間接免疫熒光和Western blot鑒定MAb
采用Western blot分析單抗與重組His — SAMHDl和His蛋白的反應活性，以及單抗與真核表達SAMHDl、pcDNA3.1空載體反應。2. 3單抗特異性分析采用Western blot分析單抗與真核表達人、猴、馬SAMHD1-HA重組蛋白及未轉染的馬皮細胞、兔腎細胞、293T細胞的反應活性，分析其特異性。2 結果2.1PCR擴增結果以提取的血液中的單個核細胞中的RNA為模板進行RT-PCR，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1878kb的片段(見圖1)，與預期大小相符。2. 2重組表達載體的鑒定結果將獲得的重組表達載體pET30a_SAMHDl用BamH I和Not I進行酶切鑒定，得到5400bp和1878bp左右的片段(見圖2)，與預期相符。2. 3重組SAMHDl蛋白SDS-PAGE電泳分析通過對表達條件的優化,確定最佳誘導溫度為16°C、最佳誘導時間為17h、IPTG濃度為O. 2mmol/L時，目的蛋白的表達量最大且主要以可溶形式存在。菌液經超聲波破碎和SDS-PAGE電泳分析，出現I條約79 k a的蛋白條帶(見圖3)，與預期相符。2. 4原核表達重組SAMHDl的純化純化的SAMHDl蛋 白分子在約79kDa處出現一條蛋白帶，與預期相符(圖4)。2. 5SAMHDI 蛋白的 Western-blot 檢測結果將純化的SAMHDl蛋白進行Western-blot檢測分析，結果表明，重組SAMHDl蛋白可與Abcam公司的SAMHDl抗體發生特異性反應,而pET30a (+) /Rosetta (DE3)與此抗體不反應(見圖5)。2. 6MAb 的 western blot 鑒定用鎳柱純化的SAMHDl為篩選抗原，建立間接ELISA方法，篩選出針對SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細胞，最終獲得一株能夠穩定分泌SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3C3，分類命名為抗人SAMHDl單克隆抗體3C3雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6709。用上述的雜交瘤細胞株分泌產生的3C3MAb檢測真核表達蛋白人SAMHDl和pcDNA3.1空白對照。檢測結果表明，此株MAb作用后產生的條帶大小均與SAMHDl蛋白大小(79KDa) 一致且與空載體對照無反應(圖6)。2. 7MAb的間接免疫熒光鑒定結果顯示，3C3單抗與人SAMHDl真核表達的蛋白呈陽性反應，并產生綠色熒光信號，對照(一抗為SP2/0上清)無綠色熒光信號(圖7)。2. 8腹水的制備及效價的測定采用間接ELISA方法測定雜交瘤細胞3C3腹水的效價為1:409600，明顯高于對應細胞上清液的效價1:640。采用Protein G成功對3C3腹水進行純化，純化后的濃度為Img/ml的SAMHDlMAb用于western blot鑒定時的稀釋倍數為5000 10000倍。2. 9單抗特異性分析本實驗用SAMHDl的全蛋白作為免疫原，制備了效價較高的MAb，抽取的2. 5ml腹水純化后可得到高產量的MAb，而且與人的SAMHDl真核表達蛋白反應性特異，可以用于實驗室檢測，此單抗不與猴、馬SAMHDl的真核表達蛋白反應，且與未轉染的293T細胞、馬皮細胞、兔腎細胞均無反應，表明其具有良好的特異性。與Abcam公司的SAMHDl抗體相比，本實驗室制備的SAMHDl抗體具有高產量的優點，且反應特異，可以用于人SAMHDl的實驗室檢測(圖 8 )。
權利要求
1.一株分泌抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3C3，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCCNO. 6709。
2.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的抗人SAMHDl蛋白的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測人SAMHDl蛋白試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株分泌人SAMHD1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株、由該細胞株分泌的單克隆抗體及應用，屬于生物技術領域。本發明將純化的人SAMHD1作為免疫原，按照常規雜交瘤細胞融合技術將免疫小鼠脾細胞與SP2/0融合，最終獲得一株能夠穩定分泌SAMHD1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3C3，其菌種保藏編號為CGMCC NO.6709。Western blot和間接免疫熒光結果表明此株雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體能特異性識別真核表達的人重組蛋白SAMHD1，而與His標簽蛋白以及真核表達的馬、猴重組蛋白SAMHD1均不發生反應。因此說明本發明的單克隆抗體能夠用于人SAMHD1蛋白的檢測。
文檔編號C12N5/20GK103060273SQ20121053506
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者王曉鈞 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所