專利名稱：一種基因抑制細胞K562-siWnt5a及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因細胞的構建，尤其涉及一種基因抑制細胞K562_siWnt5a 及其制備方法。
背景技術：
Wnt5a蛋白是一種分泌型的糖蛋白，屬于Wnt家族,在不同腫瘤中，Wnt5a發揮著不同的作用，如在它能促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤生長甚至可促使腫瘤的侵襲， 而在甲狀腺腫瘤、結腸直腸癌等腫瘤中fct5a可能發揮著抑制腫瘤的作用。Wnt5a在腫瘤發生中的作用和機理仍不清楚。
在前期的研究中，我們使白血病細胞K562細胞過表達Wnt5a基因，并研究過表達 Wnt5a對K562細胞的生物學形狀的影響(牛長春，司維柯，李軍等。穩定過表達fct5a對 K562細胞生物學性狀的影響.第三軍醫大學學報.2009; 31 (22) :2199-2201.)。為了更全面的研究Wnt5a對K562的影響，在本發明中我們使用逆轉錄病毒的方法，用siRNA干擾 K562細胞中Wnt5a基因的表達，使之處于穩定低表達水平。發明內容
本發明的目的在于提供一種基因抑制細胞K562_siWnt5a，所述基因抑制細胞 K562-siffnt5a有利于進一步的研究Wnt5a表達降低對白血病細胞的影響及機制。
本發明的技術方案是一種基因抑制細胞K562-S iWnt5a細胞，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址是中國湖北武漢武漢大學，保藏日期是2012年7月12日，保藏編號為CCTCC N0:C201291，分類命名是 K562-siWnt5a 細胞。
所述基因抑制細胞包含SEQ ID NO:1所示的基因片段Wnt5a。
所述基因抑制細胞進一步包含siRNA啟動子，所述siRNA啟動子可以來自以 PSEB-HUS為載體的逆轉錄病毒。
所述基因抑制 細胞進一步包含siRNA啟動子為H1、U6雙啟動子。
制備基因抑制細胞K562_siWnt5a細胞的方法，包含下列步驟1)質粒pSEB-HUS-Wnt5a 的構建；2)質粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL_Ampho去內毒素大量提取；3)pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 與脂質體 2000 共轉染 HEK293 細胞；4)感染K562細胞并篩選陽性細胞克隆；5)鑒定陽性細胞克隆，獲得所述基因抑制細胞K562-siWnt5a。
所述步驟I)可包含將基因片段Wint5a酶切后與pSEB-HUS載體連接。
所述步驟5)鑒定陽性克隆的方法為Real-time PCR檢測K562 mRNA表達水平及 Western Blotting檢測Wnt5a蛋白表達水平。
本發明使用逆轉錄病毒作為載體，可以把外源性的siRNA啟動子(H1，U6雙啟動子)和Wnt5a基因目標序列片段(SEQ ID NO:1 : 5-GTGGATAACACCTCTGTTT-3)整合到細胞的基因組中，從而能夠穩定內源性表達Wnt5a而不丟失,便于對Wnt5a的研究。其不同于使用轉染的方法把siRNA瞬間轉入細胞。基因抑制細胞K562-siWnt5a細胞的構建，對于進一步研發白血病診斷和預后判斷指標和Wnt5a作為基因治療靶點的研究具有重要意義，有利于進一步的研究表達過表達Wnt5a對于白血病的作用以及機制。
為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為Real-time PCR鑒定K562 mRNA表達水平結果；圖2為Western Blotting檢測Wnt5a表達水平及JNK活性的變化；圖3為pSEB-HUS質粒圖譜。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解的是，這些實施例僅用于說明本發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明基因抑制細胞K562-siWnt5a 及制備方法的簡單改進，都屬于本發明要求保護的范圍。
本發明以質粒pSEB-HUS-Wnt5a為載體包裝逆轉錄病毒，構建基因抑制細胞 K562-siWnt5a細胞，達到了使K562細胞中Wnt5a表達水平下降的效果，并且表明Wnt5a表達水平的下降可以導致JNK活性的降低。
本發明利用Western blot的方法檢測K562_Wnt5a細胞中Wnt5a蛋白表達水平的變化，證實基因抑制細胞K562-siWnt5a中Wnt5a蛋白表達量增高。
本發明制備的基因抑制細胞已保藏在中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏日期為2012年7月 12日，保藏號為CCTCC C201291，細胞名稱 K562-siWnt5a。
材料和來源菌株和質粒大腸桿菌克隆菌株DH5a購自寶生物工程有限公司，細胞株K562、HEK293 購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，中國總代理北京中原公司，pSEB-HUS (圖譜見圖3)、 pCL-Ampho(見文獻Naviaux RK, Costanzi E, Haas M, Verma IM, et al. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high—titer, recombinant retroviruses. J Virol. 1996 Aug; 70(8): 5701-5.)。
雙鏈DNA序列由Invitrogen公司合成。
序列I (SEQ ID NO: 2) 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 ；序列 2 (SEQ ID NO: 3) 5-AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT-3 序列 I 與序列 2 混合，95°C 加熱5min,后放室溫。
其他主要試劑T4 DNA連接酶、限制性內切酶Sfi I購自TAKARA公司；TIANgel Midi Purification Kit購自天根生化科技有限公司；脂質體2000(Lipofectamine 2000)、 滅痕素(Blasticidin S HCL )購自 Invitrogen 公司；質粒普通純化試劑盒與去內毒素純化試劑盒購自Omega公司；RPM1-1640, DMEM培養基購自Gibco公司；Real-time PCR檢測引物序列由Invitrogen公司合成；RNA逆轉錄cDNA試劑盒， real-time PCR試劑盒，Toyoba產品，日本。
實施例1質粒pSEB-HUS_Wnt5a的構建1.DNA小片段(siRNA祀點序列)制備單鏈DNA序列由Invitrogen公司合成。
序列I (SEQ ID NO :2) 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 ；序列 2 (SEQ ID NO :3) 5-AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT-3
序列I與序列2混合，95°C加熱5分鐘后放室溫。
2. Wnt5a重組質粒構建 ①pSEB-HUS載體酶切及回收將pSEB-HUS載體(圖3)用Sfi I酶切50°C消化3小時(酶切反應體系為16 μ 1DNA， 2 μ I限制性內切酶Sfi I，2 μ I IOXBuffer)，電泳。取酶切產物做1%瓊脂糖凝膠電泳，證實得到大小為7000bp左右的特異性片段。使用TIANgel Midi Purification Kit回收向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ I平衡液BL，12，000 rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；紫外燈下切下含特異DNA條帶的膠條，放入EP 管中稱重，加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴10分鐘直至膠條完全融化，將I個吸附柱放入收集管中，將全部樣品移入柱內，離心I分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集管中，加700μ I的漂洗液于吸附柱內，離心I分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集管中，重復洗滌，最后離心2分鐘，將吸附柱放入I個干凈的1. 5 ml離心管，加 50 μ I三蒸水于吸附柱上的膜中心，柱子放置I分鐘后離心I分鐘，收集洗脫的DNA。
②連接Τ4 DNA連接酶16°C過夜連接(連接反應體系為2 μ I Τ4 DNA Ligase,2y I 10 X T4 DNA Ligase Buffer,質粒酶切回收產物6 μ I, DNA小片段10 μ I,取一無菌離心管,加入已制備好的感受態DH5a細菌200μ 1，冰浴，吸取5μ I連接產物加入管中，轉化DH5a細菌， 輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘，加入800 μ I室溫的SOC培養液(成分2% (W/V)胰化(蛋白)胨，O. 5% (W/V)酵母提取物，O. 05% (W/V) NaCl, 2. 5 mM KCl 10 mM MgCl2, 20 mM 葡萄糖)混勻，37°C搖床 220 rpm振蕩培養 I 小時， 取50 μ I菌液涂于含氨節西林(濃度為50 μ g/mL)的LB培養板上,37°C恒溫培養箱過夜培養，次日挑取單個菌落接種于含氨芐西林的LB培養基擴大培養。
③鑒定將重組質粒pSEB-Wnt5a送往上海生工公司測序。測序的結果顯示，插入片段為 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 (SEQ ID NO:2)，與合成序列一致。重組質粒命名為 pSEB-HUS-ffnt5a0
實施例2質粒pSEB-HUS_Wnt5a和pCL-Ampho去內毒素大量提取按照 Omega質粒DNA提取試劑盒操作(Ε· Z. N. A. Fastfilter Endo-free Plasmid maxi Kit):從抗性平板上挑取質粒轉化菌落，接種于4ml含氨芐西林的LB培養基中37°C恒溫培養，8小時后接種到含有氨芐西林的IOOmlLB培養基中37°C恒溫擴大培養12-16小時。沉淀菌體，4500g，離心10分鐘，棄上清，盡量吸干，用IOml預冷的溶液I將上述細菌沉淀重懸， 劇烈振蕩，加入溶液II IOml輕輕顛倒混勻5次， 使其澄清，加入Buffer N3，溫和上下顛倒混勻后倒入針筒過濾器中，收集裂解液上清，加入O.1倍體積ETR溶液，靜置，4000g離心5 分鐘，將上清移置另一試管中，加入1/2體積的無水乙醇，顛倒5次放置5分鐘，將HiBind大量結合柱套入50ml試管中，把過濾液倒入結合柱中，4000g離心5分鐘，棄去收集管中的濾液，在結合柱中加入IOml HB Buffer，4000g離心5分鐘，棄去收集管中的濾液，在結合柱中加入15ml DNA Wash Buffer, 4000g離心5分鐘,棄去收集管中的濾液,重復使用15ml DNA Wash Buffer洗滌柱子，待柱子干燥后加入2ml預熱的ddH20，室溫放置2分鐘，5000g離心 5分鐘，收集洗脫下的DNA溶液，-20°C保存。
實施例3 pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 與脂質體 2000 共轉染 HEK293 細胞 HEK293細胞使用含10%小牛血清的完全DMEM培養液，置37 °C、5% C02細胞培養箱中(50ml細胞培養瓶)，飽和濕度下培養，當細胞處于對數生長期且細胞濃度為30-40%時準備轉染；準備轉染的試劑，包括250 μ I DMEM (無血清)、5 μ I pCL-Ampho (約O. 5-1. Oyg DNA)、10 μ I pSEB-HUS-ffnt5a (約 1.0-2· Oyg DNA)、15 μ I Lipofectamine 2000 ( Invitrogen)，混勻，放置15-20分鐘；仔細使用無血清的DMEM沖洗細胞三次，加入2. 5ml無血清的DMEM，小心加入轉染混合物；加入后3-5小時后，把培養基吸出，加入4ml完整DMEM 培養液；在36小時、60小時、84小時和108小時收集含有逆轉錄病毒的上清。-80° C保存病毒。
實施例4感染K562細胞并篩選陽性克隆使用以上所得上清液置換培養處于對數生長期的K562細胞的培養液(添加海美溴銨最終濃度為12Pg/ml)，反復感染4次后，換為含有10%小牛血清的RPM1-1640完全培養基， 培養24小時后加入滅瘟素(最終濃度為4(^g/ml)，培養6天后更換為含有10%小牛血清的 RPM1-1640完全培養基，未感染逆轉錄病毒的細胞已全部死亡，得到陽性的抗性細胞克隆。 陽性克隆細胞命名為K562-siWnt5a細胞。
實施例5提取K562細胞mRNA 以及Real-time鑒定基因Wnt5a的表達空載體pSEB-HUS包含無基因靶點的siRNA表達序列，經去內毒素大抽、與質粒pCL-Ampho共轉染HEK293細胞得到逆轉錄病毒并感染K562細胞得到抗滅瘟素的陽性細胞克隆(K562-si對照組細胞)。
提取K562_siWnt5a細胞、K562_si對照組細胞mRNA :將細胞懸液收集至離心管中，1000 1500 r/min離心5 min，棄去上清；將獲得的細胞置于EP管中，加入I ml的 TriPure試劑，反復吹打細胞或使用勻漿器將細胞裂解，室溫下孵育5分鐘；加入1. 2 ml氯仿，小心蓋好管蓋，用力劇烈振蕩15 s ,室溫下孵育2 15 min, 4 °C下12000 g,離心15 min。將得到的無色水相轉移到一個新的EP管中。加入O. 5 ml異丙醇混勻，蓋好管蓋，顛倒數次將其充分混勻，室溫下孵育5 10 min,4 1下12000 g，離心15 min，棄去上清，加 Al ml 75%乙醇，通過旋轉作用洗滌乙醇中的RNA顆粒；DEPC處理過無RNA酶的無菌水重懸RNA樣品。使用Toyoba逆轉錄試劑盒逆轉錄RNA為cDNA,反應體系(Toyoba, Japan) 無 RNA 酶的無菌純水，10. 5 μ I ；01igo(DT)20 (lOpmol/μ I)，1. O μ I RNA,1. O μ I ； 5 X RT buffer, 4. O μ I ；dNTP (10mmol/L)，2· 0 μ I ；RANase 抑制劑，O. 5 μ I ；ReverTra Ace (lOOu/μ 1),1.0 μ I。逆轉錄反應條件30 °C, 10 min ；48 °C, 120 min ；99 °C，5 min ； 4 °C, 5 min。
Real-time PCR 檢測 Wnt5a mRNA 的表達。引物Wnt5a : (SEQ ID NO :4)5，-CTTCGCCCAGGTTGTAATTGAAGC-3，，(SEQ ID NO: 5) 5’-CTGCCA AMACAGAGGTGTTATCC-3，； GAPDH (SEQ ID N0:6) 5’_GAAGGTG AAGGTCGGAGTC-3 ’， (SEQ ID NO: 7) 5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC -3’。反應體系(Toyoba, Japan):雙蒸水，6· 2 μ I ；SYBR,12.5μ I ；plus-solution, 2. 5 μ I ；上游引物，I μ I ;下游引物，I μ I ; cDNA, 2 μ I。
PCR條件為95°C預變性2分鐘，然后95°C變性10秒、58°C退火、延伸45秒，共40 個循環；每個循環結束時進行熒光檢測。GAPDH作為內參。結果如圖2所示K562-siWnt5a 細胞中Wnt5a基因mRNA表達水平低于K562_si對照組細胞(如圖1)。
實施例6 Western Blotting檢測Wnt5a表達水平及JNK活性的變化 JNK是參與非經典Wnt信號通路一個分子，其活性形式為磷酸化水平。離心收集培養瓶中細胞，O.1M PBS漂洗一次，取5X IO6細胞收集于1.5 ml離心管中， 加入100 μ I總蛋白提取液和10 μ I Cocktail (O.1M PBS溶解)，混勻，冰浴30分鐘， 10000 rpm、4°C離心15分鐘，收集上清，測定總蛋白濃度。配制10%Tricine SDS-PAGE分離膠和濃縮膠。電泳80V 30分鐘，120V I小時。電泳結束后，取下凝膠置于轉印緩沖液中平衡50分鐘，剪下凝膠大小的PVDF膜和厚濾紙，將PVDF膜在100%的甲醇中浸泡I分鐘后與濾紙一起置于轉印緩沖液中浸泡5分鐘，12V恒壓電轉印I小時，取下PVDF膜，蒸餾水洗膜5分鐘3次，TBST洗滌10分鐘3次，室溫下5%脫脂奶粉封閉膜I小時，TBST洗滌10分鐘 3 次，加入用 3%BSA/TBS 稀釋至 1:1000 的抗體(β -actin, phosphor-JNK, Wnt5a),4°C 孵育過夜，TBST洗滌10分鐘3次，加入3%BSA/TBS稀釋至1: 1000的二抗，37°C孵育2小時，TBST洗滌10分鐘3次，將發光液A和B等體積混勻制成工作液，滴于膜上，作用5分鐘， 化學發光檢測并采集圖像(如圖2)。
結果顯示K562細胞中Wnt5a mRNA表達水平下降,蛋白表達水平下降,達到了構建基因Wnt5a抑制的K562細胞的目的。并且，據報道文獻(Nomachi，A.，Nishita, Μ.， Inaba, D. , Enomoto, Μ. , Hamasaki, Μ. and Minami, Y. (2008). Receptor tyrosine kinase Ror2 mediates Wnt5a_induced polarized cell migration by activating c-Jun N-terminal kinase via actin—binding protein filamin A. J Biol Chem 283, 27973-81)，Wnt5a可以激活JNK活性，結果顯示，K562細胞中本身表達Wnt5a蛋白，并且通過與對照細胞相比，所得到細胞K562-siWnt5a細胞株穩定低表達Wnt5a基因；磷酸化JNK 表達較低，表明JNK活性受到抑制；β-actin作為內參。表明本發明中，K562細胞中Wnt5a 表達 被抑制后，可抑制Wnt5a下游信號。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學藥學院 〈120〉一種基因抑制細胞K562-siWnt5a及其制備方法 〈130〉 CN 〈160〉 7<170> PatentIn version 3. 3〈210〉 I 〈211〉 19 〈212〉 DNA〈213〉Wnt5a目的基因序列片段 〈400〉 Igtggataaca cctctgttt19〈210〉 2 〈211〉 24 〈212〉 DNA〈213〉合成的Wnt5a基因序列片段 〈400〉 2agtggataac acctctgttt tttt24〈210〉 3 〈211〉 24 〈212〉 DNA〈213〉合成的Wnt5a基因序列片段 〈400〉 3aaaacagagg tgttatccac tttt24〈210〉 4〈211〉 24〈212〉 DNA〈213〉人 工合成引物〈400〉 4cttcgcccag gttgtaattg aagc24〈210〉 5 〈211〉 24 〈212〉 DNA
權利要求
1.一種基因抑制細胞K562-siWnt5a，其保藏號為CCTCC C201291。
2.如權利要求1所述的基因抑制細胞K562-siWnt5a，其特征在于，包含SEQID NO:1 所示的基因片段fct5a。
3.如權利要求1或2所述的基因抑制細胞K562-siWnt5a，其特征在于，包含siRNA啟動子。
4.如權利要求3所述的基因抑制細胞K562-siWnt5a，其特征在于，所述siRNA啟動子為H1、U6雙啟動子。
5.如權利要求3所述的基因抑制細胞K562-siWnt5a，其特征在于，所述siRNA啟動子來自以pSEB-HUS為載體的逆轉錄病毒。
6.如權利要求1所述的基因抑制細胞K562-siWnt5a的制備方法，其特征在于，包含步驟1)質粒pSEB-HUS-Wnt5a 的構建；2)質粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL_Ampho去內毒素大量提取；3)pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 與脂質體 2000 共轉染 HEK293 細胞；4)感染K562細胞并篩選陽性細胞克隆；5)鑒定陽性細胞克隆，獲得所述基因抑制細胞K562-siWnt5a。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟I)包含將基因片段Wnt5a酶切后與pSEB-HUS載體連接。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟5)所述鑒定陽性細胞克隆為 Western blot鑒定Wnt5a蛋白的表達。
全文摘要
本發明涉及一種基因抑制細胞K562-siWnt5a及其制備方法，其中基因抑制細胞K562-siWnt5a的保藏號為CCTCCC201291。所述制備方法主要包含步驟質粒pSEB-HUS-Wnt5a的構建，質粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho去內毒素大量提取，pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho與脂質體2000共轉染HEK293細胞，篩選和鑒定陽性細胞克隆。構建的基因抑制細胞K562-siWnt5a細胞，有利于進一步的研究過表達Wnt5a對于白血病的作用和機制。
文檔編號C12N5/10GK103060272SQ20121053428
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者司維柯, 牛長春, 趙宸, 潘靜, 張曉麗, 吳瑋銣 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學藥學院