SYBR Green 熒光染料DNA定量檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及DNA定量檢測方法和檢測試劑盒。本發明建立了SYBR?Green?I熒光染料法對DNA定量的條件，得到了該方法的線性范圍和靈敏度，可以快速、準確的得到DNA樣品的精確含量。本發明還構建制備了質粒分子和基因組DNA標準品，采用數碼PCR法對兩種DNA標準品進行準確定量，利用該標準質粒或基因組DNA進行梯度稀釋，得到SYBR?Green?I熒光染料法定量DNA的標準曲線，根據標準曲線得到待測DNA樣品的準確含量。
【專利說明】SYBR Green熒光染料DNA定量檢測方法和試劑盒
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種檢測基因組DNA和質粒DNA的方法和檢測試劑盒，特別是涉及一種SYBR Green I熒光染料DNA定量檢測試劑盒。
【背景技術】:
[0002]在分子生物學領域進行DNA分析時常常需要對基因組DNA和質粒DNA進行準確定量。
[0003]采用Pic0Green熒光染料法對核酸進行定量，因其方法的靈敏度高、線性范圍廣，因此應用非常廣。然而，PicoGreen熒光染料價格昂貴，且在對DNA進行定量時的局限性表現在方法的準確度高低取決于試劑盒中DNA標準品含量的準確度，而目前市售的試劑盒中DNA標準品的含量值均為廠家提供的一個參考值，這個值一般是通過紫外吸收(0D260)確定的，沒有相關的不確定度信息和溯源性。其次，由于PicoGreen對不同分子大小的DNA結合效率會有差異，如果依據定量的DNA標準和所測定的DNA樣本分子大小差異很大時，會導致對樣本定量結果的偏差很大，而目前商業化的試劑盒中均只有一個分子大小的LambdaDNA標準。有報道稱:以Lambda為標準，如果對分子量<23kb的DNA進行定量，測定結果會比真實結果偏低。因此，如果對質粒DNA采用PicoGreen法定量，由于質粒DNA標準品的缺乏，現有的商業化的試劑盒還無法滿足要求。
[0004]SYBR Green I熒光染料的與PicoGreen相比價格低。經我們的研究發現SYBRGreen I對雙鏈DNA結合具有很好的效率，而結合單鏈DNA效率很低。目前，SYBR Green I熒光染料法普遍用于定量PCR擴增過程中與DNA結合或者通過染膠進行定量，還沒有SYBRGreen I直接與質粒DNA或基因組DNA結合進行定量的方法與試劑盒。研制SYBRGreen I對DNA定量的試劑盒，需要具有準確量值的DNA標準物質，目前并沒有含有準確量值的DNA標準可用作SYBR Green I法定量質粒的標準。由于該量值直接關系到試劑盒定量方法的準確度高低。基于單分子擴增的數字PCR方法可對DNA進行絕對定量，從而為SYBR GreenI熒光染料法提供DNA標準。

【發明內容】
:
[0005]本發明的目的是提供一種DNA熒光染料定量檢測方法和檢測試劑盒，該方法靈敏度高，線性范圍廣，準確度高，精密度好。
[0006]為達到上述發明目的，本發明人進行了如下研究工作:
[0007]1、SYBR Green I熒光染料對不同分子大小的DNA定量的線性關系
[0008]選擇了分子大小分別為5k，9k，48k的質粒/基因組分子作為研究對象，將DNA進行梯度稀釋，稀釋后的DNA與PicoGreen熒光染料結合后，測定熒光信號；
[0009]結果發現:熒光信號不僅與DNA濃度成正比(相關系數>0.99)，還與DNA分子大小相關，即分子量越大，線性相關曲線的斜率越大。
[0010] 2、SYBR Green I熒光染料法對質粒DNA定量的線性范圍[0011]將質粒DNA稀釋至0.01ng/mL~10000ng/mL，與熒光染料結合后，測定熒光信號值；
[0012]結果發現DNA濃度在0.05ng/mL~1000ng/mL之間時，熒光強度與DNA濃度成正t匕。因此，SYBR Green I對質粒DNA定量的線性范圍為0.25ng/mL~1000ng/mL。
[0013]3、SYBR Green I熒光染料法對質粒DNA的檢測靈敏度
[0014]由于最低檢測到的熒光信號對應的DNA濃度為0.01ng/mL，加樣量100 μ L ;
[0015]因此計算出該方法的靈敏度為lpg。
[0016]4、SYBR Green I熒光染料法對質粒DNA的定量限
[0017]根據最低定量的線性范圍，定量限為5pg。
[0018]5、SYBR Green I熒光染料法對Lambda基因組DNA定量的線性范圍
[0019]將基因組DNA稀釋至0.001ng/mL~10000ng/mL，與熒光染料結合后，測定熒光信號值，結果發現DNA濃度在0.01ng/mL~1000ng/mL之間時，熒光強度與DNA濃度成正比；
[0020]因此，SYBRGreen I 對 Lambda DNA 定量的線性范圍為 0.01ng/mL ~1000ng/mL。
[0021]6、SYBR Green I熒光染料法對Lambda基因組DNA的檢測靈敏度
[0022]由于最低檢測到的熒光信號對應的DNA濃度為0.005ng/mL，加樣量100 μ L，因此計算出該方法的靈敏度為0.5pg。
`[0023]7、SYBR Green I熒光染料法對Lambda基因組DNA的定量限
[0024]根據最低定量的線性范圍，定量限為lpg。
[0025]根據以上研究，本發明首次建立了質粒和基因組SYBR Green I DNA熒光染料法定量檢測方法，可對質粒或基因組DNA進行準確定量。本方法的步驟為:
[0026]I)將待測樣品稀釋至DNA濃度為0.01~Ing/ μ L，與熒光染料混勻，用酶標儀讀取所得到的熒光信號強度值；
[0027]2)將標準品進行梯度稀釋，得到4~8個DNA濃度的稀釋液；取每一種濃度的標準品稀釋液分別與熒光染料混勻后，用酶標儀分別讀取每一種濃度所得到的熒光信號強度值；
[0028]3)根據步驟2)得到的不同濃度DNA標準品的熒光強度值繪制標準曲線，根據此標準曲線計算待測樣品DNA的濃度；
[0029]其特征為:所用的標準品為用數字PCR法準確定量的環狀質粒分子DNA或基因組DNA ;熒光染料是SYBR Green I。
[0030]本方法中，用酶標儀讀取熒光信號前，設置所述酶標儀激發波長480nm，吸收波長為 520nm。
[0031]所述稀釋用以下成分的工作液進行:10mM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8.0 ；
[0032]進行步驟I)之前，采用紫外法測定待測DNA樣品大致的濃度范圍。
[0033]步驟I)和步驟2)中，所用的熒光染料根據需要進行稀釋，比如，在實施例中，規格10000X的SYBR Green I。使用前按照1:10000進行稀釋。
[0034]測定熒光信號強度時，稀釋的待測樣品與染料等體積混勻；每一種濃度的標準品稀釋液分別與染料等體積混勻。
[0035]本方法中，標準品稀釋液的優選濃度分別為lng/μ L、0.5ng/y L、0.25ng/y L、
0.lng/ μ L 和 0.01ng/ μ L。[0036]所述數字PCR法的具體操作如下:
[0037]I)用紫外法測定待測物DNA的濃度，然后將此濃度根據分子量和阿伏加德羅常數從ng/ μ I換算成copy/ μ I,然后將DNA通過天平稱量用ΤΕ0.1稀釋至1200copies/ μ I備用；
[0038]2)配置dPCR反應體系:取DNA模板2 μ 1，與8 μ I的PCR master mix混勻；
[0039]3)將配置好的PCR體系加入芯片中對應的樣品孔，轉入芯片中的每個反應室；然后進行PCR擴增；
[0040]4)數據處理:得到的數據結果進行分析處理，根據得到的陽性分子個數，利用泊松分布計算DNA濃度。
[0041]根據上述方法，本發明提供了一種SYBR Green I熒光染料DNA定量檢測試劑盒，包括:質粒DNA標準品，基因組DNA標準品，SYBR Green I熒光染料和工作液。所述工作液的成分是:10mM Tris-HCl，含 ImM EDTA，pH=8.0。
[0042]本方法的創新點和優點是:
[0043]1、首次采用標準質粒作為熒光染料法中的DNA標準對質粒樣品進行定量；采用標準基因組DNA作為熒光染料法中的DNA標準對基因組DNA樣品進行定量；
[0044]2、彌補了現有商業化熒光染料試劑盒中不能對質粒DNA進行定量的缺點；
[0045]3、方法靈敏度高:該方法可檢測低至0.5pg的基因組DNA，低至Ipg的質粒DNA ；
[0046]4、方法線性范圍廣:可檢測0.01ng/mL~1000ng/mL的DNA,跨越5個數量級；
[0047]5、標準品的量值:首次采用高準確度的數字PCR法對標準質粒和基因組DNA進行定量，得到的量值不確定度低，準確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0048]圖1為熒光染料法對不同分子大小的DNA定量的線性相關性；
[0049]圖2為熒光染料法對質粒DNA定量的線性范圍研究；
[0050]圖3為熒光染料法對質粒DNA定量的線性范圍；
[0051]圖4為熒光染料法對基因組DNA定量的線性范圍研究；
[0052]圖5為熒光染料法對基因組DNA定量的線性范圍；
[0053]圖6為數字PCR方法對標準質粒和基因組DNA定值的熱圖
[0054]圖7數字PCR方法對待側質粒的定量的熱圖；
[0055]圖8為兩種方法(SYBR Green熒光染料法與數字PCR法)測定結果比較。
【具體實施方式】
[0056]以下所用的實驗材料來源如下:
[0057]熒光染料SYBR Green I，I X 10000，購自北京華邁科生物技術公司；
[0058]PCR master mix, 2 X,購自 Life technology 公司。
[0059]實施例1對不同分子大小DNA采用SYBR Green I熒光染料法進行定量
[0060]一、材料與方法:
[0061]1.不同分子大小的 DNA:lambda基因組DNA,大小48kb,購置Takara公司；9kbDNA:采用EcoRI限制性內切酶將Lambda基因組DNA進行酶切，通過瓊脂糖凝聚電泳回收純化得到 ;質粒DNA:5kb ；PCR產物:200bp。
[0062]2.SYBR Green I熒光染料用IxTE按照1:10000進行稀釋。
[0063]3.將I中提到的四種不同分子大小的DNA配置成10000ng/mL的保存濃度，然后用IxTE 稀釋至 2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL。
[0064]4.取稀釋好的DNA溶液0.1mL與0.1mL的稀釋好的SYBR Green I染料混合，轉移至96孔酶標板。
[0065]5.將酶標板至于酶標儀上,選擇激發波長480nm,發射波長520nm進行突光信號的米集。
[0066]6.標準曲線的繪制:以DNA濃度為橫坐標，以熒光信號為縱坐標進行曲線繪制，各分子量大小的DNA得到的標準曲線見圖1。
[0067]二、實驗結果
[0068]1、SYBR Green I熒光染料對不同分子大小的DNA定量的線性相關性:
[0069]表1
[0070]
【權利要求】
1.一種SYBR Green熒光染料DNA定量檢測方法，步驟為: 1)將待測樣品稀釋至DNA濃度為0.01~Ing/yL，與熒光染料混勻，用酶標儀讀取所得到的熒光信號強度值； 2)將標準品進行梯度稀釋，得到4~8個DNA濃度的稀釋液；取每一種濃度的標準品稀釋液分別與熒光染料混勻后，用酶標儀分別讀取每一種濃度所得到的熒光信號強度值； 3)根據步驟2)得到的不同濃度DNA標準品的熒光強度值繪制標準曲線，根據此標準曲線計算待測樣品DNA的濃度； 其特征為:所用的標準品為用數字PCR法準確定量的環狀質粒分子DNA或基因組DNA ；熒光染料是SYBR Green I。
2.權利要求1所述的方法，用酶標儀讀取熒光信號前，設置所述酶標儀激發波長480nm,吸收波長為520nm。
3.權利要求1所述的方法,所述稀釋用以下成分的工作液進行:IOmMTris-HCl，含ImMEDTA，pH=8.0。
4.權利要求1所述的方法，進行步驟I)之前，采用紫外法測定待測DNA樣品大致的濃度范圍。
5.權利要求1所述的方法，步驟I)和步驟2)中，所用的熒光染料的工作濃度為0.1uM,測定熒光信號強度時，稀釋的待測樣品與染料等體積混勻；每一種濃度的標準品稀釋液分別與染料等體積混勻。
6.權利要求1所述的方法，得到的標準品稀釋液濃度分別為lng/yL、0.5ng/yL、0.25ng/ μ L、0.lng/ μ L 和 0.01ng/ μ L。
7.權利要求1所述的方法，所述數字PCR法的具體操作如下: O用紫外法測定待測物DNA的濃度，然后將此濃度根據分子量和阿伏加德羅常數從ng/ μ I換算成copy/ μ I,然后將DNA通過天平稱量用ΤΕ0.1稀釋至1200copies/ μ I備用； 2)配置dPCR反應體系:取DNA模板2μ 1，與8 μ I的PCR master mix混勻； 3)將配置好的PCR體系加入芯片中對應的樣品孔，轉入芯片中的每個反應室；然后進行PCR擴增； 4)數據處理:得到的數據結果進行分析處理，根據得到的陽性分子個數，利用泊松分布計算DNA濃度。
8.—種DNA定量檢測試劑盒，試劑盒中包括熒光染料、工作液和標準品，其特征為:所述熒光染料是SYBR Green I ;所述標準品為濃度有準確量值環狀質粒分子DNA和/或基因組 DNA。
9.權利要求8所述的試劑盒，量值確定的方法為數字PCR法，具體操作如權利要求7。`
10.權利要求8所述的試劑盒，所述工作液的成分為IOmMTris-HCl，含ImM EDTA,pH=8.00
【文檔編號】C12Q1/68GK103865984SQ201210540389
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月13日 優先權日:2012年12月13日
【發明者】王澤廣, 吳立娟, 董杰 申請人:王澤廣