專利名稱：突變噬菌體e基因、含該基因的打孔質粒載體及其在制備疫苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發是明涉及一種經基因突變后獲得的PhiX174噬菌體E基因的DNA及其制備方法,還涉及含有該DNA的打孔質粒載體,還進一步涉及該打孔質粒載體在制備疫苗菌脫中的應用，屬于生物基因工程領域。
背景技術：
在細菌中表達PhiX174噬菌體E裂解基因，能夠通過滲透壓的作用使細菌的細胞膜破裂，造成細菌細胞內的胞漿和核酸成分流出，而形成一種空的細菌外殼，即為“bacterial ghost”(菌脫)。由于菌脫和活菌具有一樣的細菌膜結構擔保和相關抗原蛋白，與通過甲醛等化學方法滅活的細菌比較其刺激機體產生免疫反應的抗原物質未發生變性，因此菌脫是良好的候選疫苗。目前E蛋白介導的溶解已經成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎少門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、支氣管敗血博德特氏桿菌等。但是，如果菌脫作為疫苗使用，尤其是對于強致病性細菌時，此時就需要菌脫中不含活菌，否則在使用菌脫免疫動物時，容易造成動物因感染強致病性活菌而發病。雖然菌脫已經廣泛應用于革蘭氏陰性菌中，對于ToplO、DH5a等基因工程大腸桿菌的裂解效果較好，而對于野生型大腸桿菌或者其革蘭氏陰性菌的裂解效果一般。因此，有必要提高E基因的裂解效果。禽沙門氏菌病在世界各 地普遍存在，對養禽業的危害性很大。提高E基因對禽沙門氏菌的裂解效果，有利于增加禽沙門氏菌菌脫作為候選疫苗的可能性。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種突變噬菌體E基因；本發明的目的之二在于提供上述突變噬菌體E基因的制備方法；本發明的目的之三在于提供含上述突變噬菌體E基因的打孔載體；本發明的目的之四在于構建含上述突變噬菌體E基因的打孔載體的方法；本發明的目的之五在于將上述突變噬菌體E基因應用于制備禽沙門氏菌菌脫疫苗。本發明是通過以下技術方案來實現的一種突變噬菌體E基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示。該突變噬菌體E基因相對于PhiX174噬菌體E基因在禽少門氏菌中的表達量大大提高。一種突變噬菌體E基因的制備方法，其特征在于順次包括以下步驟I)通過引物 1(SEQ ID NO :3)和引物 2(SEQ ID NO :4)進行 PCR 擴增獲得 PhiX174噬菌體E基因并測序，其序列為SEQ ID NO 2所示；2 )對序列為SEQ ID NO :2所示的E基因進行點突變，E基因點突變后的序列為SEQID NO 1 所示。將本發明的突變噬菌體E基因與PMD18-T等可操作性載體連接，即可得到打孔載體。具體地，一種構建含上述突變噬菌體E基因的打孔載體的方法，使用引物3 (SEQID NO :5)和引物4 (SEQ ID NO :6)將上述的突變噬菌體E基因與pMD18_T載體相連接。一種制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟I)在含氨芐青霉素的LB中接種含權上述突變噬菌體E基因的打孔載體的基因工程大腸桿菌，培養后提取表達載體質粒；2 )使用電極儀或者氯化鈣轉化法把表達載體質粒轉入禽沙門氏菌中，在含氨芐青霉素的LB固體培養板中培養，通過PCR鑒定并挑取含表達載體質粒的陽性禽沙門氏菌；3)誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達；4)收集溶菌結束后形成的禽沙門氏菌菌脫，用純水洗滌，-20°C保存。優選地，步驟I)所述表達載體質粒通過如下方法獲得把突變噬菌體E基因與PMD18-T載體相連接，然后轉入Top感受態細胞，并取IOOul該培養液均勻涂布于含氨芐青霉素100ug/mL的LB瓊脂平板上，放入37°C培養箱；等培養板干了之后，倒置培養10_14h，挑白色單菌落進行擴大培養，并提取質粒；使用Sac I和BamH I對含有突變噬菌體E基因的質粒進行雙酶切；突變噬菌體E基因的雙酶切產物與使用Sac I和BamH I雙酶切后的化學誘導型表達載體或溫控型表達載體連接在一起，然后轉入Top感受態細胸，挑取陽性菌落，擴大培養后提取質粒，即獲得化學誘導型表達載體質粒或溫控型表達載本質粒。優選地，步驟3)誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達可通過下面兩種方法進行a)化學誘導型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達當禽沙門氏菌濃度OD值達到0. 3時，加入0. 5M的IPTG 在37°C的溫度下進行誘導培養；b)溫控型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達當禽沙門氏菌濃度OD值達到0. 3時，在42°C的溫度下進行誘導培養。與現有技術相比，本發明的有益效果是本發明的突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中的表達量大大高于現有噬菌體E基因在禽沙門氏菌中的表達量；本發明的突變噬菌E基因相對于現有噬菌體E基因對禽少門氏菌的裂解率提高了 30-70%，增加了禽沙門氏菌的菌脫可作為候選疫苗的可能性。


圖1為突變前后PhiX174噬菌體E基因連接化學誘導型表達載體在禽沙門氏菌中的表達效果圖，其中，M為蛋白Marker，NC為空白對照組(4h) ;1、2為PhiX174噬菌體E基因表達組分別為2h、4h取樣，3、4為突變噬菌體E基因表達組分別為2h、4h取樣；圖2為突變前后PhiX174噬菌體E基因連接溫控型表達載體在禽沙門氏菌中的表達效果圖，其中，M為蛋白Marker，NC為空白對照組(4h) ;1、2為PhiX174噬菌體E基因表達組分別為2h、4h取樣，3、4為突變噬菌體E基因表達組分別為2h、4h取樣；圖3為PhiX174噬菌體E基因突變前后裂解禽沙門氏菌菌脫的透射電鏡圖，其中，A為PhiX174噬菌體E基因突變前裂解禽沙門氏菌菌脫的透射電鏡圖，B為PhiX174噬菌體E基因突變后裂解禽沙門氏菌菌脫的透射電鏡圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例子對本發明作進一步詳細說明。實施例1突變PhiX174噬菌體E基因的制備方法首先，通過引物IE IS ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3' (SEQ ID NO :3)和引物 2EIA TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3' (SEQ ID NO 4)PCR 擴增獲得 PhiX174 噬菌體 E 基因并測序，其序列如SEQ ID NO 2所示:
權利要求
1.突變噬菌體E基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO 1所示。
2.—種權利要求1所述的突變噬菌體E基因的制備方法，其特征在于順次包括以下步驟 1)通過序列為SEQID NO :3所示的引物I和序列為SEQ ID NO :4所示的引物2進行PCR擴增獲得PhiX174噬菌體E基因并測序，其序列為SEQ ID NO 2所示； 2)對序列為SEQID NO :2所示的E基因進行點突變，E基因點突變后的序列為SEQ IDNO 1所示。
3.含權利要求1所述的突變噬菌體E基因的打孔載體。
4.如權利要求3所述的打孔載體，其特征在于該打孔載體是將權利要求1的突變噬菌體E基因與pMD18-T載體可操作性相連接得到的。
5.一種構建權利要求4所述的含突變噬菌體E基因的打孔載體的方法，其特征在于使用序列為SEQ ID NO 5所示的引物3和序列為SEQ ID NO 6所示的引物4將權利要求1的突變噬菌體E基因與pMD18-T載體相連接。
6.一種制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟 I)在含氨芐青霉素的LB中接種含權利要求3的打孔載體的基因工程大腸桿菌，培養后提取表達載體質粒； 2 )使用電極儀或者氯化鈣轉化法表達載體質粒轉入禽沙門氏菌中，在含氨芐青霉素的LB固體培養板中培養，通過PCR鑒定并挑取含表達載體質粒的陽性禽沙門氏菌； 3)誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達； 4)收集溶菌結束后形成的禽沙門氏菌菌脫，用純水洗滌，一20°C保存。
7.如權利要求6所述的制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于步驟I) 所述表達載體質粒通過如下方法獲得把突變噬菌體E基因與pMD18 — T載體相連接，然后轉入Top感受態細胞，并取IOOul該培養液均勻涂布于含氨芐青霉素100ug/mL的LB瓊脂平板上，放入37°C培養箱；等培養板干了之后，倒置培養10 - 14h，挑白色單菌落進行擴大培養，并提取質粒；使用Sac I和BamH I對含有突變噬菌體E基因的質粒進行雙酶切；突變噬菌體E基因的雙酶切產物與使用Sac I和BamH I雙酶切后的化學誘導型表達載體或溫控型表達載體連接在一起，然后轉入Top感受態細胸，挑取陽性菌落，擴大培養后提取質粒，即獲得化學誘導型表達載體質粒或溫控型表達載本質粒。
8.如權利要求6或7所述的制備禽沙門氏菌菌脫疫苗的方法，其特征在于步驟3)誘導突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中表達可通過下面兩種方法進行 a)化學誘導型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達當禽沙門氏菌濃度OD值達到O.3時，加入O. 5M的IPTG在37°C的溫度下進行誘導培養； b)溫控型表達載體質粒在在禽沙門氏菌中表達當禽沙門氏菌濃度OD值達到O.3時，在42°C的溫度下進行誘導培養。
全文摘要
本發明涉及生物基因工程領域，公開了一種經基因突變后獲得的PhiX174噬菌體E基因的DNA，其序列號如SEQIDNO1所示，還公開了上述DNA的制備方法以及含該DNA的打孔質粒載體及其在制備疫苗中的應用。本發明的突變噬菌體E基因在禽沙門氏菌中的表達量大大高于現有噬菌體E基因在禽沙門氏菌中的表達量；其相對于現有噬菌體E基因對禽少門氏菌的裂解率提高了30－70%，增加了禽沙門氏菌的菌脫可作為候選疫苗的可能性。
文檔編號C12N15/63GK103045614SQ201210541108
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者徐家華, 陳瑞愛, 張東霞, 湯欽, 黃妙容 申請人:肇慶大華農生物藥品有限公司, 廣東大華農動物保健品股份有限公司