專利名稱：一種體外擴增nk細胞的方法
一種體外擴增NK細胞的方法本發明涉及NK細胞的培養擴增方法，具體涉及一種體外大量擴增NK細胞的方法。自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)是屬淋巴細胞譜系,含有穿孔蛋白和粒酶顆粒的細胞毒淋巴細胞。其對靶細胞的識別無MHC限制性，無需預先致敏即可直接殺傷腫瘤細胞，也可分泌細胞因子調節其他免疫細胞的功能，是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心調節細胞，在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細胞中發揮重要作用。有研究證明自然殺傷細胞其實不僅是天然免疫系統中的重要作用成分，它同樣具有獲得性免疫細胞的一些特征。在免疫系統中，NK細胞反應的速度比T細胞或B細胞要快，其作用機制主要是識別靶細胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶和分泌多種細胞因子，迅速溶解某些腫瘤細胞，發揮調節免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。但由于NK細胞在人外周血中的含量極低及腫瘤組織中分布頻率較低(〈10% )，僅占單個核細胞的5%-10%，極大的限制了 NK細胞作為過繼免疫細胞在臨床上的應用。多年來，人們一直嘗試能在體外實現NK細胞的大量擴增，但是目前的常規技術主要是在體外培養體系中加入IL-2、IL-12、IL-15和Y -1FN等因子組合來促進NK的擴增，經過一段時間的培養后僅可以使NK細胞擴增幾倍或十幾倍，純度亦不理想，因此也不能滿足實際的應用。并且這種方法因子需求量較大，成本較高，培養效果不穩定，不適合體外大規模的應用。為了解決現有技術中NK細胞擴增后純度不理想、成本較高等問題，本發明提供一種新的NK細胞的體外擴增的方法，可在體外培養條件下獲得大量的、細胞純度高、殺傷活性強的NK細胞。為實現上述目的，設計一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步驟組成a.將外周血單個核細胞接種在⑶3McAb和⑶226McAb預包被的培養瓶中共培養，b.加入IL-2和IL-18共培養72小時以刺激擴增NK細胞， c.將NK細胞與經致死處理的K562細胞和含有IL_2和IL-18的無血清培養基轉入細胞培養袋中共培養，d.收獲NK細胞。本發明還有如下的優化方案用CD3McAb和CD226McAb可用作促進IL-2和IL-18的合成和ADCC作用。用⑶226提升NK細胞中表面活化分子⑶69的表達水平、細胞因子IFNy的分泌和殺傷顆粒⑶107a的表達水平。步驟b具體為，加入IL-2和IL-18，并放入37°C、5%C02的飽和濕環境中培養72小時。
步驟c具體為，根據細胞生長情況持續補充含有IL-2和IL-18的無血清培養基。
步驟c中，所述的NK細胞與經致死處理的K562細胞的細胞數比例為1:1。致死處理為K562細胞經IOOGy劑量的Y射線照射致死。
外周血單個核細胞的濃度優選為1. 5 XlOVml ο所述⑶3 McAb的使用優選濃度為 100ng/ml。所述CD226 McAb的使用濃度為優選50ng/ml 200ng/ml。所述CD226 McAb的最佳使用濃度為100ng/ml。所述IL-2使用濃度優選為500IU/ml。所述IL-18使用濃度優選為5ng/mf50ng/ml。所述IL-18最佳使用濃度為10ng/ml。所述無血清培養基還含有人血白蛋白，人血白蛋白使用濃度為O. 5%。
與常規的僅單純向培養體系中添加多種細胞因子的NK細胞培養方法相比，本發明具有如下優點
1.將⑶3McAb和⑶226McAb兩種抗體同時包被，不僅⑶3可促進細胞因子合成和 ADCC作用，同樣作為NK細胞活化受體的⑶226的功能也得到證實，⑶226可以引起NK細胞表面活化分子⑶69的表達升高，細胞因子(IFNy)的分泌與殺傷顆粒(CD107a，GranzymeB) 的表達都明顯升聞，顯者提聞了 NK細胞的殺傷毒性；
2.轉袋處理在包被的培養瓶中培養3天后，再將細胞轉入細胞培養袋中，這樣既可以保證NK細胞被充分激活，又避免了高濃度抗體對細胞的持續作用誘發的凋亡，并且同等條件下細胞培養袋的效果要優于細胞培養瓶；
3.僅僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現 了對NK細胞的激活和擴增，IL_2 可刺激NK細胞表達大量的IL-2R α鏈，從而使NK細胞大量增殖，并且在IL2刺激下NK細胞表達黏附分子，使NK胞質中的顆粒增加并促進絲氨酸酯酶mRNA的表達，從而提高NK細胞的細胞毒活性；而IL-18可以誘導NK細胞分泌IFN- Y，并具有促進NK細胞的增殖、活化及Fas介導的殺傷功能，并且可通過胞內的ITAM達到促進NK細胞活化的作用。常規NK細胞培養體系中使用的因子組合中還用到了 IL-12、IL-15和IFN-Y等，本發明僅在體外培養體系中使用了兩種細胞因子，即保證了 NK細胞的擴增倍數和細胞毒性，又降低了細胞培養的成本。[


]
圖1是本發明與常規培養方法NK細胞擴增倍數的比較 圖2是本發明方法所得NK細胞純度圖3是常規培養方法所得NK細胞純度圖4是本發明與常規培養方法所得NK細胞對K562細胞殺傷活性的比較圖。[具體實施方式
]
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明。本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
實施例1
一、外周血單個核細胞(PBMC)的分離和NK細胞的培養
通過血細胞分離機采集患者外周血單個核細胞(PBMC)，將采集的血樣轉至離心管；700g，離心分離lOmin，吸取上層血漿培養時備用；用O. 9%生理鹽水血樣將標本還原至原體積，混勻；將稀釋血緩慢加在Ficoll上，900g，離心20min ;吸取分離液界面乳白色單個核細胞層；離心洗滌2次并計數；用培養基將PBMC重懸，并調整細胞濃度至1. 5 X 10 6/ml，轉入預先用CD3McAb及CD226McAb包被的75cm2培養瓶中，加入500IU/ml的IL-2和10ng/ml的IL-18，培養72小時，將細胞離心收集起來，計數，并與相同細胞數量的經IOOGy劑量的Y射線照射致死的K562細胞混合，用含有O. 5%人血白蛋白的無血清培養基調整細胞濃度為lX106/ml，補加IL-2和IL-18至原濃度，轉入細胞培養袋中培養，以后每2-3天添加含相同濃度IL-2和IL-18的無血清培養基，維持細胞濃度在3 X 106/ml左右，14天后即可得到大量擴增的高純度、高毒性的NK細胞。二、本方法與常規方法的細胞擴增倍數的比較分別在第0、7、14及21天從兩組取培養細胞，用臺盼藍染色后計數，將計數當天的細胞總數除以培養前的細胞數(即第O天)，數值即為細胞的擴增倍數。以此方法可以動態比較兩組細胞的擴增情況，結果如表I和圖1所示在培養的第7、14、21天，本法的NK細胞擴增倍數均顯著高于常規組P〈0. 01。表1:
權利要求
1.一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步驟組成a.將外周血單個核細胞接種在⑶3McAb和⑶226McAb預包被的培養瓶中共培養，b.加入IL-2和IL-18共培養72小時以刺激擴增NK細胞，c.將NK細胞與經致死處理的K562細胞和含有IL-2和IL-18的無血清培養基轉入細胞培養袋中共培養，d.收獲NK細胞。
2.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于用CD226提升NK細胞中表面活化分子⑶69的表達水平、細胞因子IFNy的分泌和殺傷顆粒⑶107a的表達水平。
3.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(b)為，加入IL-2和 IL-18，并放入37°C、5%C02的飽和濕環境中培養72小時。
4.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(c)中，根據細胞生長情況持續補充含有IL-2和IL-18的無血清培養基。
5.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(c)中，所述的NK細胞與經致死處理的K562細胞的細胞數比例為1:1。
6.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于外周血單個核細胞的濃度為1. 5 X IO6 /ml ο
7.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述CD226McAb的使用濃度為 50ng/ml 200ng/ml。
8.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述IL-18的使用濃度為 5ng/ml 50ng/ml。
9.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述無血清培養基中含有人血白蛋白，所述人血白蛋白使用濃度為O. 5%。
10.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述所述CD3McAb的使用濃度為100ng/ml。
全文摘要
本發明涉及NK細胞的培養擴增方法，具體涉及一種體外大量擴增NK細胞的方法，a.將外周血單個核細胞接種在CD3McAb和CD226McAb預包被的培養瓶中共培養，b.加入IL-2和IL-18共培養72小時以刺激擴增NK細胞，c.將NK細胞與經致死處理的K562細胞和含有IL-2和IL-18的無血清培養基轉入細胞培養袋中共培養，d.收獲NK細胞，本發明將CD3McAb和CD226McAb兩種抗體同時包被，促進細胞因子合成和ADCC作用，顯著提高了NK細胞的殺傷毒性，僅僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現了對NK細胞的激活和擴增，即保證了NK細胞的擴增倍數和細胞毒性，又降低了細胞培養的成本。
文檔編號C12N5/0783GK102994449SQ201210541658
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者葉永清, 楊雪晶, 蘇國新 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司