專利名稱：一種鳥糞石體外模型的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種鳥糞石體外模型的構建方法，屬于醫學領域。
背景技術：
鳥糞石是由解脲酶微生物所引起的人類常見腎結石之一。主要由六水磷酸銨鎂/碳酸磷灰石所組成。為了預防鳥糞石的生成和復發以及研究如何溶解鳥糞石，必需建立鳥糞石的體外模型。我國目前尚無鳥糞石體外模型建立的研究。構建有效的鳥糞石體外模型有利于在體外觀察鳥糞石形成的物 理過程，以及在體外進行化學溶石的研究。

發明內容
本發明為了解決現有技術的上述不足，提供了一種鳥糞石體外模型的構建方法。本發明的上述目的通過以下的技術方案來實現
本發明是使用Griffith法配制了人工尿液，將稀釋后的奇異變形桿菌液接種于人工尿液中，奇異變形桿菌產生的解脲酶將人工尿中的尿素分解為氨和CO2，氨水可增加尿pH值，銨與尿中的鎂和磷酸根結合成磷酸銨鎂呈高度過飽和而析出，同時，在堿性尿液中，鈣和磷酸根合成磷灰石，并與來自尿素的二氧化碳結合成碳酸磷灰石，當這些成石物質達到過飽和時，結晶也將迅速形成，由此可以設計建立實驗結石模型。前述結晶形成的兩項核心技術是人工尿液的溫度和菌液的濃度。結晶經過紅外光譜分析，確認為碳酸磷灰石與磷酸銨鎂的混合性結晶即鳥糞石。一種鳥糞石體外模型的構建方法，其特征在于包括以下步驟
A、取IOOml無菌玻璃試管，在超凈工作臺將人工尿液80ml轉移至試管；
B、將O.5麥氏濁度菌液O. 8ml加入人工尿液，38— 42°C孵育；
(、于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小時分別取51111試管內液體，取其中IOOul液體，點
于96孔板內，并以顯微鏡觀察攝片；
D、其余以紫外分光光度計檢測0D600吸光度，記錄讀數；
E、檢測完的人工尿液2000rpmIOmin低速離心，取上清檢測pH值，記錄讀數；
F、24小時后離心收集晶體，0.05MpH8.6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以紅外光譜及及偏振光顯微鏡分析。所述人工尿液，以g/L計，各成分含量如下CaC12 · 2H20,0. 651 ； MgCl2 · 6H20，
0.651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04,2. 3 ；KH2P04,2. 8 ；KC1,1. 6 ；NH4C11. 0 ；Urea, 25. 0 ；Creatine,
1.1 ;肉湯培養基，10. 0。所述0. 5麥氏濁度菌液的制備方法，包括以下步驟
A、從孵育了18-24小時的瓊脂平板上挑出單個菌落，用鹽水制成懸液；
B、在光線充足的地方，背對著有白色背景與黑色對比線條的卡片，將接種管與O.5號麥氏標準管進行目測比較，將菌懸液調至O. 5麥氏濁度。所述O. 5號麥氏標準管的制備方法為將O. 117g氯化鋇溶于10mlddH20，濃度為O. 048M, Iml 濃硫酸加入 99mlddH20 得 O. 18M 硫酸；取 O. 5ml O. 048M 氯化鋇加 99. 5ml0. 18M硫酸制得O. 5麥氏比濁管，約相當于I 2X 108CFU/ml。本發明與現有技術相比的優點是采用本發明的構建方法，鳥糞石體外模型的結晶形成率高，有利于在體外觀察鳥糞石形成的物理過程，以及在體外進行化學溶石的研究。
具體實施例方式下面結合具體實施 對本發明進一步詳述
1、實驗材料 1.1試劑
Mueller-Hinton (M-H)肉湯培養基，Mueller-Hinton (M-H)瓊脂培養基，氯化I丐、氯化鎂、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化銨、尿素及肌酸均為普通分析純試劑。1. 2 菌種 奇異變形桿菌。1. 3 儀器
電子分析天平；紫外分光光度計；酸度計；酶標儀；超凈工作臺；恒溫培養箱；倒置顯微鏡；低溫超速離心機；傅里葉變換式紅外光譜分析儀(天津LIIR);偏振顯微鏡。2、實驗方法
2.1人工尿液制備
Griffith法配制人工尿液，各成分含量(g/L)如下CaC12 · 2H20，0. 651 ；MgC12 · 6Η20，0· 651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04,2. 3 ；KH2P04,2. 8 ；KC1,1.6 ；NH4C11. 0 ；Urea,25. 0 ；Creatine,l.1 ;肉湯培養基，10. 0，調節pH至5. 8。于超凈工作臺內O. 22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存備用。2. 2 O. 5麥氏單位比濁管制備
將O. 117g氯化鋇溶于10mlddH20，濃度為O. 048M, Iml濃硫酸加入99mlddH20得O. 18M硫酸。取O. 5ml O. 048M氯化鋇加99. 5ml0. 18M硫酸制備O. 5麥氏比濁管，約相當于I 2X108CFU/ml
2.3菌液制備
①從孵育了 18-24小時的瓊脂平板上挑出單個菌落，用鹽水制成懸液。②在光線充足的地方，背對著有白色背景與黑色對比線條的卡片，將接種管與O. 5號麥氏標準管進行目測比較，將菌懸液調至O. 5麥氏濁度。2. 4體外模型建立
①取IOOml無菌玻璃試管，在超凈工作臺將人工尿液80ml轉移至試管。②將O. 5麥氏濁度菌液O. 8ml加入人工尿液，40°C孵育(不能低于38°C，或高于42。。)。③于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小時分別取5ml試管內液體，取其中IOOul液
體，點于96孔板內，并以顯微鏡觀察攝片。④其余以紫外分光光度計檢測0D600吸光度，記錄讀數。⑤檢測完的人工尿液低速離心(2000rpm IOmin),取上清檢測pH值，記錄讀數。
⑥24小時后離心收集晶體，O. 05M pH8. 6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以紅外光譜及及偏振光顯微鏡分析。2.5結石成分的紅外光譜分析
全部結石均采用天津LIIR型紅外光譜自動分析系統分析。測試前，將用結石清水洗凈后晾干后放入70-100°C烘箱內烘干。取出后取約Img結石樣品粉末與事先充分干燥的200mg純溴化鉀混合，再放入瑪瑙乳缽內研碎至2 μ m以下。隨后將混合物用壓片機加壓，制成半透明片，迅速置入紅外光譜槽中掃描。電腦繪制譜圖，并自動解析和報告結石成分。但是，上述的具體實施方式
只是示例性的，是為了更好的使本領域技術人員能夠理解本專利，不能理解為是對本專利包括范圍的限制；只要是根據本專利所揭示精神的所作的任何等同變更或修飾，均落入本專利包括的 范圍。
權利要求
1.一種鳥糞石體外模型的構建方法，其特征在于包括以下步驟 A、取IOOml無菌玻璃試管，在超凈工作臺將人工尿液80ml轉移至試管； B、將O.5麥氏濁度菌液O. 8ml加入人工尿液，38— 42°C孵育； (、于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小時分別取51111試管內液體，取其中IOOul液體，點于96孔板內，并以顯微鏡觀察攝片； D、其余以紫外分光光度計檢測0D600吸光度，記錄讀數； E、檢測完的人工尿液2000rpmIOmin低速離心，取上清檢測pH值，記錄讀數； F、24小時后離心收集晶體，0.05MpH8.6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以紅外光譜及及偏振光顯微鏡分析。
2.根據權利要求1所述的一種鳥糞石體外模型的構建方法，其特征在于所述人工尿液，以 g/L 計，各成分含量如下=CaCl2 · 2H20,0. 651 ； MgCl2 · 6H20,0. 651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04，2.3 ;KH2P04，2. 8 ；KC1,1. 6 ；NH4C11. 0 ；Urea,25. 0 ；Creatine,1.1 ;肉湯培養基，10. 0。
3.根據權利要求2所述的一種鳥糞石體外模型的構建方法,其特征在于所述O.5麥氏濁度菌液的制備方法，包括以下步驟 A、從孵育了18-24小時的瓊脂平板上挑出單個菌落，用鹽水制成懸液； B、在光線充足的地方，背對著有白色背景與黑色對比線條的卡片，將接種管與O.5號麥氏標準管進行目測比較，將菌懸液調至O. 5麥氏濁度。
4.根據權利要求3所述的一種鳥糞石體外模型的構建方法,其特征在于所述O.5號麥氏標準管的制備方法為將O. 117g氯化鋇溶于10mlddH20，濃度為O. 048M, Iml濃硫酸加入99mlddH20得O. 18M硫酸；取O. 5ml O. 048M氯化鋇加99. 5ml0. 18M硫酸制得O. 5麥氏比濁管。
全文摘要
本發明公開了一種鳥糞石體外模型的構建方法，使用Griffith法配制了人工尿液，將稀釋后的奇異變形桿菌液接種于人工尿液中，奇異變形桿菌產生的解脲酶將人工尿中的尿素分解為氨和CO2，氨水可增加尿pH值，銨與尿中的鎂和磷酸根結合成磷酸銨鎂呈高度過飽和而析出，同時，在堿性尿液中，鈣和磷酸根合成磷灰石，并與來自尿素的二氧化碳結合成碳酸磷灰石，當這些成石物質達到過飽和時，結晶也將迅速形成，由此可以設計建立實驗結石模型。本發明與現有技術相比的優點是采用本發明的構建方法，鳥糞石體外模型的結晶形成率高，有利于在體外觀察鳥糞石形成的物理過程，以及在體外進行化學溶石的研究。
文檔編號C12P3/00GK103014069SQ201210543388
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月16日 優先權日2012年12月16日
發明者呂建林 申請人:呂建林