專利名稱：一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法
技術領域：
本發明屬于鯽魚消化吸收率分析技術領域，涉及ー種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法。
背景技術：
魚類對飼料中營養物質的充分利用是魚類快速生長的必要條件，因此其對營養物質的消化吸收直接影響魚類生產性能的提高。在飼料配方中，把鯽魚對飼料的消化吸收率進行準確評價以選擇優良飼料是確保鯽魚高效養殖的重要前提。消化吸收率是評價飼料營養價值的重要指標之一。而目前對其研究的方法主要有兩種體外消化法和體內消化法。體外消化法雖簡便但無法反映體內消化的真實情況，所以缺乏可靠性，已很少采用。體內試驗法又分為直接法和間接法兩種。直接法由于工作量太·大而沒有間接法那樣應用廣泛。無論是直接法還是間接法，都存在糞便的收集問題，操作繁瑣。相關研究發現，⑶X2作為ー種腸道上皮細胞特異性核轉錄因子，對腸道發育以及營養物質在腸道內消化吸收起著關鍵性作用。它調控了機體內糖代謝、脂肪代謝、蛋白質代謝和礦物元素代謝等相關功能基因的表達，并對腸道上皮細胞増殖、分化具有重要的調節作用。在實踐中發現，CDX2基因的相對表達量隨著鯽魚消化吸收率的升高而升高，降低而降低。于是就產生了用⑶X2基因作為鯽魚消化吸收率的ー個分子標志，進而用來評價鯽魚對某種飼料消化吸收的程度，具有重要的理論指導意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，該方法能夠對鯽魚的消化吸收率進行準確的評定并能預測其以后腸道消化吸收的潛力，為鯽魚的飼料配方優化提供技術支持。本發明提供的技術方案是一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法包括以下步驟
(I)取待檢測的鯽魚，解剖井分離出腸道，將腸道投入保存液中，以用于基因表達的分
析；
(2 )提取第(I)步中的腸道總RNA ；
(3)反轉錄合成cDNA；
(4)以第(3)步中的cDNA為模板，用CDX2引物進行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示,下游核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；
(5 )實時熒光定量PCR檢測，其中，目的基因引物為所述的CDX2引物，熒光定量內參基因引物為管家基因P-Actin引物，該引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；
(6)定量PCR結束后，從擴增曲線得出Ct值，計算CDX2基因的表達量，CDX2基因的表達量=2_AA ，其中A A Ct= (Ct目的基因-Ct管家基因)-A Ct校準樣，根據⑶X2基因的表達量來判斷鯽魚消化吸收率的高低，即CDX2基因的表達量高，鯽魚的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表達量低，鯽魚的消化吸收率低。上述的基因分析方法，第(4)步cDNA片段克隆的PCR反應體系2XPCR Taq Mix12.5 ML，上、下游引物各I ML，cDNA I ML，ddH20加至25 ML ;PCR反應流程94で預變性3 min，95°C變性 30 s，55°C退火 20 s，72°C延伸 20 s，35 個循環，72 °C延伸 10 min,4°C 10min0上述的基因分析方法，第(5)步實時熒光定量PCR檢測，按照SYBR Green I染料法要求，ニ步法進行定量PCR，反應體系Takara SYBR Premix Ex Taq 12. 5 ML、濃度10PM的上下游引物各0.5 ML、cDNA 2 ML、ddH20加至25 ML，反應程序95 V 30 s，95 V 3 s、55 °C 25 s、72 °C 11 s 共40個循環，95 °C I min、55 °C 30 s、95 °C 30 s 終止，4 °C保存。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果
(I)本發明提供的用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，將傳統的化學分析方法提高到分子水平的基因分析方法，操作簡單且準確率高。(2)以腸道上皮細胞特異性核轉錄因子⑶X2基因的表達作為鯽魚腸道消化吸收率的評定方法，根據其表達量的高低來進行鯽魚消化吸收率的分析，不但可以從分子水平快速方便對鯽魚消化吸收率進行評定，還可以對其以后腸道消化吸收的潛能進行評定，方法簡單且準確率高，能夠為鯽魚飼料配方優化提供技術支持。


圖I :丁酸鈉對鯽魚腸道CDX2基因相對表達量的影響；
圖2 :CDX2基因的相對表達量與干物質表觀消化率建立的數學模型。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進ー步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。本發明提供一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，通過對腸道上皮細胞特異性核轉錄因子CDX2基因進行定量PCR表達分析，根據其在鯽魚腸道中的表達量，進而從分子水平上評定鯽魚的消化吸收率，下面檢測丁酸鈉對鯽魚腸道CDX2基因表達量和消化吸收率的影響。以初始體重(6. 02±0. 16)ダ的鯽魚為研究對象，在鯽魚基礎飼料中分別添加0. 0g/kg、1.0 g/kg、2.5 g/kg、5. 0 g/kg、7. 5 g/kg的包膜丁酸鈉,配制5種等氮等能的實驗飼料。飼料配方如下各原料組份按重量百分比為面粉8%、淀粉20%、豆柏32%、魚粉28%、豆油3%、魚油3%、氯化膽堿0. 5%、磷酸ニ氫鈣1%、三氧化ニ鉻0. 5%、甲基纖維素2%、預混料2%。其中預混料可為每公斤飼料提供VA 20 mg ^B1 10 mg ；VB2 15 mg ；VB6 15 mg ；VB128 mg ；煙酸胺 100 mg ；VC(35%) 1000 mg ;泛酸I丐 40 mg ;生物素 2 mg ;肌醇 200 mg ;葉酸 10 mg ；VE 400 mg ；VK 320 mg ；VD 310 mg ；MgS04 7H20 600 mg ；ZnSO4 7H20 600 mg ；MnS04 7H2080 mg ；ki I. 5 mg ；Na2Se03 3 mg ；CoCl *6H20(10%) 5 mg ；CuSO4 *5H20 30 mg ；NaCl 100 mg ；次粉150 mg ;沸石粉4780. 5mg ;抗氧化劑200 mg。研究不同濃度包膜丁酸鈉通過促進鯽魚腸細胞增殖對其生長作用的影響。實驗在室內養殖系統中進行，每水族缸飼喂30尾 ，每處理組3個重復，以魚體重3% — 5%投喂量，日投喂3次，試驗持續7周。其中，對照組投喂的飼料中包膜丁酸鈉含量為0.0 g/kg，四個實驗組投喂的飼料中包膜丁酸鈉含量分別為L 0 g/kg、2. 5 g/kg、5.0 g/kg、7. 5 g/kg。試驗結束后，用本發明檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，對上述各組的鯽魚進行基因表達分析，具體過程如下
(1)隨機取待檢測的鯽魚3尾，在冰盤上解剖井分離出腸道，樣品迅速投入RNAfixer(RNA fixer購自北京百泰克生物技術有限公司)保存液中，用于基因表達的分析；
(2)從NCBI中查詢并下載斑馬魚(NM_001098762)、塞內加爾多鰭魚(DQ522900)的⑶X2基因序列，DNAMAN軟件查找基因的同源保守區。用Primer Premier 5. 0軟件設計引物，用于下面步驟CDX2基因的cDNA片段克隆和實時熒光定量PCR檢測。參照金魚管家基因3-actin(AB039726)設計內參引物Actin，作為熒光定量內參基因引物，設計的兩對引物見表I :
表I
基 s
Si fjGiyiCJIClBTGCTOTCIlCJlGlimf CSEQ ID Ns. U
__As WTli irDiCTOSTn iWnC4* ￡ SSI HI iii.2) _
Ss yMMMOccmmAMnTMTMX:m-y Csi 11 .3)
CM2 -
__ Jki S^ttJffTOCJlfiOliACGTMre-f (SK I No. 4)_
(3)按照總RNA提取試劑盒說明書(試劑盒為E.Z. N. A. Total RNA Kit II，購自OMEGA公司)提取待檢測鯽魚前腸組織總RNA。(4)反轉錄合成cDNA，DNA酶消化總RNA樣品(3吒總RNA/1 ML DNase)。cDNA第一鏈的合成(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒，購自 Fermentas 公司)RNA 模板 I ML、0.5 u g /ML oligo(dT) 18 引物 I ML、DEPC 處理的 dd H2O 補足 12M-L, 65で水浴5 min。簡短離心立即放在冰上lmin,加入5 X Reaction Buffer 4 M-L>40 U/M-L RNase Inhibitor I ML、IOmM dNTP Mix 2 M-L>Transcriptase I ML,簡短離心立即放在42 °C水浴60 min, 70で終止反應10 min, -20で保存。(5)CDX2 基因的 cDNA 片段克隆，PCR 反應體系2 X PCR Taq Mix 12. 5 ML、CDX2基因上下游引物各I ML、cDNA I ML、ddH20加至25 ML。PCR反應流程94で預變性3 min,95°C變性 30 s，55°C退火 20 s，72°C延伸 20 S，35 個循環，72 °C延伸 10 min, 4°C 10 min ；
(6)實時熒光定量PCR檢測，根據Kenneth等設計的比較閾值法來測定目的基因在不同組織的相對表達量。按照SYBR Green I染料法要求，ニ步法進行定量PCR(SYBR PremixEx Taq TM II 試劑盒，購于 TaKaRa)。反應體系Takara SYBR Premix Ex Taq 12. 5 ML、上下游引物 S、A (10 iiM)各 0. 5 ML、cDNA 2 ML、ddH20 加至 25 ML。反應程序95 V 30 s,95 0C 3 s、55 °C 25 s、72 °C 11 s 共 40 個循環，95 °C I min,55 °C 30 s、95 °C 30 s終止，其中，目的基因引物為CDX2引物，熒光定量內參基因引物為管家基因@-Actin引物。
(7)定量PCR結束后，從擴增曲線得出Ct值，根據Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)計算基因引物的擴增效率和分析熔解曲線，以確定引物和擴增參數達到進行熒光定量檢測組織相對表達量的要求。各樣品引物PCR擴增的Ct值由各自的擴增曲線分別得出，并根據公式A A Ct= (Ct目的基因-Ct管家基因)-A Ct 校準樣(參考 Chillaron J, Roca R, Valencia A, et al. Heteromericamino acid transporters: biochemistry, genetics, and physiology[J]. AmericanPhysiological Society, 2001, 281(6) :995-1018.),其中 A Ct 校準樣設置為 8，計算出樣品中基因⑶X2 mRNA相對表達豐度，然后作圖。根據⑶X2基因的表達量來判斷鯽魚消化吸收率的高低，即⑶X2基因的表達量高，鯽魚的消化吸收率高，相反，⑶X2基因的表達量低，鯽魚的消化吸收率低。本發明中的引物合成均由博尚生物技術公司完成；所使用的儀器有=StratageneMx3000p實時熒光定量PCR儀，S1000 Thermal Cycler PCR擴增儀，購自美國；BYY_6B型穩壓穩流電泳儀，DZKW-4電子恒溫水浴鍋，購自北京；BI0FUGE tresco臺式離心機，BS224S電子天平，購自德國。實驗結果表明與對照組相比，丁酸鈉添加量達到2. 5 g/kg吋，鯽魚干物質與蛋白質表觀消化率、腸道CDX2基因的相對表達量顯著升高，分別比對照組提高8. 36%,6. 21%和56. 43%0°〈0. 05)。而且鯽魚干物質與蛋白質表觀消化率隨著腸道⑶X2基因相對表達量的升高而升高，下降而下降，呈現的規律與本發明描述內容相一致，具體請見表2和圖I。表2 丁酸鈉對鯽魚飼料表觀消化率的影響
權利要求
1.一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，其特征在于包括以下步驟 (I)取待檢測的鯽魚，解剖并分離出腸道，將腸道投入保存液中，以用于基因表達的分析； (2 )提取第(I)步中的腸道總RNA ； (3)反轉錄合成cDNA； (4)以第(3)步中的cDNA為模板，用CDX2引物進行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示,下游核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； (5 )實時熒光定量PCR檢測，其中，目的基因引物為所述的CDX2引物，熒光定量內參基因引物為管家基因β-Actin引物，該引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； (6)定量PCR結束后，從擴增曲線得出Ct值，計算CDX2基因的表達量，CDX2基因的表達量=2_ΔΔ ，其中Λ Λ Ct= (Ct目的基因-Ct管家基因)-Λ Ct校準樣，根據⑶X2基因的表達量來判斷鯽魚消化吸收率的高低，即CDX2基因的表達量高，鯽魚的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表達量低，鯽魚的消化吸收率低。
2.根據權利要求I所述的基因分析方法，其特征在于第(4)步cDNA片段克隆的PCR反應體系2XPCR Taq Mix 12.5 μ ，上、下游引物各 I μ ，cDNA I μ , ddH20 加至 25 μ ；PCR反應流程94 °C預變性3 min，95°C變性30 s，55°C退火20 s，72°C延伸20 s，35個循環，72 °C延伸 10 min,4°C 10 min。
3.根據權利要求I所述的基因分析方法，其特征在于第(5)步實時熒光定量PCR檢測，按照SYBR Green I染料法要求，二步法進行定量PCR，反應體系Takara SYBR PremixEx Taq 12. 5 μ 、濃度 10 μ M 的上下游引物各 O. 5 μ , cDNA 2 μ , ddH20 加至 25 μ ,反應程序95 °C 30 s，95 °C 3 s、55 °C 25 s、72 °C 11 s 共 40 個循環，95 °C I min,55 °C.30 s、95 V 30 s 終止，4 °C保存。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測鯽魚腸道消化吸收率的基因分析方法，以在鯽魚腸道細胞中調控營養物質消化吸收的關鍵轉錄因子CDX2的表達作為分析鯽魚消化吸收率的依據，根據其熒光定量PCR結果來進行分子水平的分析，既涵蓋傳統的消化吸收率評定方法，又提出了更為方便的基因分析來進行評定選擇鯽魚腸道細胞中CDX2基因的定量表達結果與傳統濕式灰化定量法測的鯽魚表觀消化率呈正相關作為評定依據。與傳統方法相比，本發明可以從分子水平準確的對鯽魚表觀消化率和以后的腸道消化吸收潛能進行評定，方法簡單、方便，能夠為鯽魚飼料配方優化提供技術支持。
文檔編號C12Q1/68GK102952890SQ20121055001
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者劉臻, 魯雙慶, 周毅, 孫浪 申請人:長沙學院