專利名稱：一種促進(jìn)植酸酶在畢赤酵母中表達(dá)的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種含翻譯調(diào)控因子Hacl的表達(dá)載體及含有該載體的畢赤酵母工程菌。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的異源表達(dá)是常用分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一；特別是對(duì)于エ業(yè)化生產(chǎn)而言，超水平表達(dá)是提高生產(chǎn)效率和節(jié)省成本的關(guān)鍵手段之一。蛋白質(zhì)異源表達(dá)的宿主很多，有原核微生物，如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等；也有真核微生物，如畢赤酵母和里氏木霉等。原核生物具有代時(shí)短，生長(zhǎng)快的優(yōu)點(diǎn)；但是去缺乏胞內(nèi)翻譯后修飾系統(tǒng)。因此，原核生物的異源表達(dá)蛋白往往沒(méi)有活性，或者說(shuō)表達(dá)水平很低(張小霞等，2004，國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè))。而真核微生物具有翻譯后修飾系統(tǒng)，同時(shí)往往又具有分泌表達(dá)和高密度發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)；因此，越來(lái)越多的真核微生物被開(kāi)發(fā)來(lái)應(yīng)用于生產(chǎn)エ業(yè)酶和食品酶等。無(wú)論是學(xué)術(shù)研究還是規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，畢赤酵母(Pichia pastoris)是最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一(Porro等,2005, Mol.Biotechnol.)。但是，畢赤酵母的蛋白質(zhì)表達(dá)水平非常低，多數(shù)工程菌胞外分泌的目的蛋白含量約為 8g/L (Niebaur 等，2005, Protein expression technologies)。有很多因素影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平，如啟動(dòng)子，拷貝數(shù)，信號(hào)肽、密碼偏愛(ài)性，翻譯修飾和發(fā)酵エ藝等(Payne等2008, Appl.Environ.Microbiol.)。但是,研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母胞內(nèi)的很多促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，囊泡運(yùn)輸和跨膜運(yùn)輸?shù)囊蜃幽茱@著提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能運(yùn)輸?shù)桨狻Ｈ绻庠吹鞍追g后不能正確折疊，貝U會(huì)引起蛋白非正確反應(yīng)，簡(jiǎn)稱UPR反應(yīng)(unfolded protein response,簡(jiǎn)稱UPR)。UPR會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄和反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，從而影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平(Alimjan,2010，Appl Microbiol BiotechnoD0 UPR反應(yīng)能調(diào)控胞內(nèi)很多與蛋白表達(dá)相關(guān)因子的表達(dá)，如分子伴侶，折疊酶、囊泡運(yùn)輸相關(guān)的激酶和轉(zhuǎn)錄因子HaclP等(Mouna,2010,Microbial Cell Factories ),其中 HaclP 能促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)(Saloheimo, 2003，Mol.Microbiol)。HaclP的表達(dá)是受到UPR嚴(yán)格調(diào)控的。Hacl_mRNA是組成型表達(dá)的，但是其內(nèi)部含有I個(gè)內(nèi)含子；只有內(nèi)含子被剪切后，Hacl-mRNA才能正確表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含翻譯調(diào)控因子Hacl的表達(dá)載體，并通過(guò)將該表達(dá)載體導(dǎo)入產(chǎn)外源植酸酶的畢赤酵母工程菌，構(gòu)建得到新的工程菌。所述工程菌中外源植酸酶的表達(dá)水平得到了顯著提高，具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明一方面提供一種用于表達(dá)翻譯調(diào)控因子Hacl基因的真核表達(dá)載體。上述翻譯調(diào)控因子Hacl基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。上述翻譯調(diào)控因子Hacl基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:3。

上述表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ。
本發(fā)明還提供一種提高植酸酶在畢赤酵母工程菌中表達(dá)的方法，是將上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)植酸酶的畢赤酵母工程菌中，形成新的重組工程菌。上述的重組工程菌為畢赤酵母SDLH-1 (Pichia pastoris SDLH-1),已于2012年12月5日保藏于位于武漢珞珈山武漢大學(xué)的“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCCN0:M 2012503。本發(fā)明還提供了上述畢赤酵母工程菌SDLH-1的應(yīng)用，用于高效表達(dá)外源植酸酶。本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)翻譯調(diào)控因子Hacl基因的表達(dá)載體，同時(shí)將該載體導(dǎo)入產(chǎn)植酸酶的畢赤酵母工程菌，得到新的工程菌。該工程菌表達(dá)植酸酶的水平得到顯著提高，表達(dá)量提高17%以上。


圖1:本發(fā)明構(gòu)建的用于表達(dá)翻譯調(diào)控因子Hacl基因的真核表達(dá)載體的質(zhì)粒遺傳圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是為了更好地說(shuō)明闡述本發(fā)明內(nèi)容，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實(shí)施例1: Hacl基因的克隆1.1總DNA的提取將畢赤酵母過(guò)夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min,棄上清；加入 400ii I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS) ; 95°C加熱5min，然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u I IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm離心lOmin，取上清;加入2倍體積的無(wú)水こ醇，-20°C放置30min ； 13000 rpm離心lOmin，棄上清；用70%こ醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于-20°C保存。1.2基因克隆采用融合PCR方法克隆基因，相應(yīng)的Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司。在GenBank上查詢獲得了畢赤酵母的Hacl核酸序列SEQ ID NO:1。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 3條PCR引物，分別命名為F-Hacl-EcoRl，R-Hacl-Notl和R-Hacl-N (引物具體序列見(jiàn)表I)，來(lái)擴(kuò)展去內(nèi)含子的Hacl成熟型mRNA的DNA序列。表I引物具體序列
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)載體，所述的載體為用于表達(dá)翻譯調(diào)控因子Hacl基因的真核表達(dá)載體。
2.按權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的翻譯調(diào)控因子Hacl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
3.按權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的翻譯調(diào)控因子Hacl基因的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
4.按權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的真核表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ。
5.一種提高植酸酶在畢赤酵母工程菌中表達(dá)的方法，是將權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)植酸酶的畢赤酵母工程菌中，來(lái)構(gòu)建新的重組工程菌。
6.一種工程菌，是用權(quán)利要求5所述的方法構(gòu)建的。
7.按權(quán)利要 求6所述的工程菌，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M 2012503。
全文摘要
本發(fā)明為一種促進(jìn)植酸酶在畢赤酵母中表達(dá)的載體，屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有翻譯調(diào)控因子Hac1的載體。在表達(dá)植酸酶的畢赤酵母工程菌中導(dǎo)入上述載體后，工程菌的植酸酶表達(dá)水平得到顯著提高。畢赤酵母表達(dá)工程菌具有胞外分泌和和翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)，因此，超水平表達(dá)畢赤酵母工程菌可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)省發(fā)酵成本。
文檔編號(hào)C12R1/84GK103088052SQ20121055002
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者黃亦鈞, 程斯達(dá), 康麗華, 王華明, 許麗紅, 劉艷萍, 吳秀秀 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司