專利名稱：一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法
一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程和生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，該方法以分泌纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶活力高且淀粉酶活力低的微生物預(yù)處理黃姜原料，然后利用雙酶法高溫水解淀粉得到水解糖并同時滅活預(yù)處理用的微生物；再結(jié)合膜分離清潔生產(chǎn)水解糖和黃姜皂素，或者利用產(chǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物的微生物發(fā)酵直接利用掉水解糖，在得到胞內(nèi)產(chǎn)物的同時，實(shí)現(xiàn)黃姜皂苷與水解糖分離。
背景技術(shù)：
黃姜，學(xué)名盾葉薯蕷，多年生草本植物，是我國特有的藥材，含2 3%的黃姜皂素 (薯蕷皂苷元)。黃姜皂素是留體激素藥物合成的初級原料，可加工成180多種藥物，被稱為藥物中的黃金。黃姜還含有30 40%的淀粉，40 50%的纖維素，用途廣泛。黃姜皂素是薯蕷屬植物中黃姜皂苷的配基，以黃姜皂苷的形式存在，其中水溶性皂苷占90%左右，脂溶性皂苷占10%左右。自然狀態(tài)下，黃姜皂苷被黃姜細(xì)胞壁中大量的纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等物質(zhì)所包裹，并伴有木質(zhì)素存在，其結(jié)構(gòu)緊密，機(jī)械強(qiáng)度大，難以破壞。
傳統(tǒng)的黃姜皂素生產(chǎn)采用直接酸解法，這一工藝不僅酸用量大，導(dǎo)致廢水廢渣排放量大，每生產(chǎn)I噸黃姜皂素會產(chǎn)生至少500噸廢水和8 9噸廢渣，廢水中COD濃度高達(dá) 30000 50000mg/L，污染極其嚴(yán)重，而且淀粉也難以再利用，此法黃姜皂素收率較低，大量使用溶劑汽油，易燃易爆，十分危險(xiǎn)。我國湖北省十堰市是黃姜的主要種植和黃姜皂素生產(chǎn)加工地區(qū)，位于南水北調(diào)的源頭，大量未經(jīng)處理高糖高酸廢水的排放將嚴(yán)重威脅到南水北調(diào)的水質(zhì)安全，引起社會各界的廣泛關(guān)注。
為減少黃姜皂素生產(chǎn)帶來的污染，人們試圖將黃姜皂苷同淀粉、纖維素以及果膠等分開，以減少酸的用量和廢水廢渣的排放量，我國每年黃姜皂素的產(chǎn)量約1500噸，同時能生產(chǎn)至少75000噸淀粉副產(chǎn)品，因此，對于黃姜淀粉的綜合利用，逐漸引起人們的關(guān)注， 如黃進(jìn)和張聲華從黃姜中提取葡萄糖副產(chǎn)品(申請?zhí)?0131274.X)，余盛樹利用黃姜原料同時生產(chǎn)出皂素和酒精兩個產(chǎn)品(申請?zhí)?2138773. 7)，劉慧、王焰新和鮑建國利用黃姜酶解糖液制備保健糖漿(黃姜生產(chǎn)皂素副產(chǎn)酶解糖液生產(chǎn)保健糖漿的方法(申請?zhí)?200510018758. 9)等。這些研究都綜合利用了黃姜淀粉，但尚存在黃姜皂素收率較低、污染依然較嚴(yán)重等問題，黃姜皂素的清潔生產(chǎn)工藝研究顯得尤為迫切。
國內(nèi)圍繞黃姜皂素清潔生產(chǎn)技術(shù)研究取得的一些進(jìn)展，主要有十堰秦嶺中地科技公司的“直接分離法”清潔生產(chǎn)技術(shù)，該工藝是通過物理方法對黃姜進(jìn)行粉碎后壓濾沖洗先分離纖維素，再從淀粉與黃姜皂苷混合物中分離出淀粉，再酸解提取皂素，因此，用酸量減少85%,每生產(chǎn)I噸阜素可回收淀粉12噸、纖維素15噸,但此方法酸水解之前需要先濃縮含黃姜皂苷的溶液，耗費(fèi)電量較大，而且還需增加黃姜洗皮去須預(yù)處理步驟，用水量很大，皂素收率較低，且在淀粉和纖維素中殘留的皂苷含量仍然較高，淀粉和纖維素需要進(jìn)一步純化才能被綜合利用，因此，生產(chǎn)成本依然很高。中國地質(zhì)大學(xué)、竹溪創(chuàng)藝公司發(fā)明的“糖化膜分離水解”清潔 生產(chǎn)工藝，即通過對黃姜漿料進(jìn)行液化糖化，使黃姜中淀粉轉(zhuǎn)化為糖，再通過膜分離技術(shù)將糖溶液與渣料分離，淀粉糖得到回收利用，渣料酸解提取皂素。該技術(shù)皂素回收率較高，每生產(chǎn)I噸黃姜皂素酸用量減少60%以上，且廢水排放量小于70噸， 但也存在一些突出問題需要進(jìn)一步解決，如流失了大量水溶性黃姜皂苷、工藝路線較長、膜分離需要進(jìn)行三級分離操作難度大、運(yùn)行成本高等。黃姜皂苷被黃姜細(xì)胞壁中大量的纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等物質(zhì)所包裹，并伴有木質(zhì)素存在，其結(jié)構(gòu)緊密，機(jī)械強(qiáng)度大，難以破壞。因此，提取它的步驟通常需要采用一些方法使植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變得松散，促進(jìn)黃姜皂苷釋放出來。在本發(fā)明的申請人2010年已公布的專利(申請?zhí)?01010152619. 6)技術(shù)中，公布了先使用蒸汽爆破和多種酶協(xié)同處理黃姜原料，得到含黃姜皂苷的淀粉水解糖液， 然后采用微生物發(fā)酵利用水解糖生產(chǎn)胞外有機(jī)酸，并將發(fā)酵過程與多級膜分離耦合，實(shí)現(xiàn)菌體濃縮回流到發(fā)酵罐高效利用水解糖大量生產(chǎn)有機(jī)酸，同時膜分離進(jìn)一步將有機(jī)酸和黃姜皂苷分開，使黃姜皂苷得到濃縮富集，再使用少量的薯蕷皂苷酶或酸將黃姜皂苷水解為黃姜皂素。這一技術(shù)可以大幅減少酸和有機(jī)溶劑的用量，實(shí)現(xiàn)了利用黃姜原料清潔生產(chǎn)黃姜皂素聯(lián)產(chǎn)有機(jī)酸，但也還存在預(yù)處理時間偏長(20 30小時)，乳酸、琥珀酸等胞外發(fā)酵產(chǎn)物與水溶性黃姜皂苷混合存在于發(fā)酵液中增加了膜分離難度等問題。
綜上所述，黃姜皂素清潔生產(chǎn)工藝要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，還需要進(jìn)一步解決上述發(fā)明存在的各種問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供了一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，整個生產(chǎn)工藝避免了大量使用強(qiáng)酸長時間高溫處理以及大量使用有機(jī)溶劑，生產(chǎn)過程十分安全、操作工藝簡單，且用時較短、用水量少、能耗低，同時黃姜皂素易于提取、收率高，并實(shí)現(xiàn)了黃姜淀粉高值化利用。總生產(chǎn)成本較低，工業(yè)化應(yīng)用效益顯著。
本發(fā)明提供的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步驟
第I步微生物處理釋放黃姜皂苷步驟
按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1: 5 1: 10混合均勻制成漿液，在漿液中接種微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，該微生物能分泌包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶和木聚糖酶中的任二種或二種以上，但分泌淀粉酶能力小于或者等于O.1U每毫升發(fā)酵液，得到含大量黃姜皂苷和淀粉的微生物發(fā)酵液；
第2步雙酶法處理上述微生物發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并從發(fā)酵液的固體顆粒中進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
向上述發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入6萬 10萬單位(U) α-淀粉酶，在pH值 4. O 7. O、溫度90 92°C條件下液化5min 30min，發(fā)酵液中微生物此時已被高溫滅活， 不會利用水解糖；將高溫發(fā)酵液冷卻至60°C以下后，再按黃姜干重每千克加入6萬 10萬單位(U)糖化酶，在pH4. O 7. O、溫度40 60°C條件下糖化6h 24h，得到含有大量黃姜皂苷和水解糖的黃姜糖化醪；
第3步固液分離黃姜糖化醪步驟`
通過固液分離去除上述黃姜糖化醪中未被酶解的固體殘?jiān)蜏缁畹奈⑸铮玫浇?jīng)第2步處理后形成的含有大量黃姜皂苷和水解糖的混合液，即糖化液；
第4步糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟
通過以下兩種方式分離上述糖化液中含有的黃姜皂苷和水解糖
第一種方式通過微濾得到清液，再通過納濾裝置，截留分子量較大的黃姜皂苷， 濾過分子量較小的水解糖，分別得到濃縮的黃姜皂苷溶液和水解糖溶液兩種粗產(chǎn)品；
第二種方式以上述糖化液為碳源，配制培養(yǎng)基，滅菌后接種耐黃姜皂苷且產(chǎn)大量胞內(nèi)產(chǎn)物的菌株，發(fā)酵后固液分離，將菌體及黃姜皂苷溶液分開，分別得到富含胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物的菌體和黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品；
第5步水解含黃姜皂苷的溶液獲得黃姜皂素粗品；
第6步所述黃姜皂素粗品再經(jīng)混合有活性炭的有機(jī)溶劑提取即得到黃姜皂素，所述活性炭的質(zhì)量百分比濃度為O. 3 O. 8%。
上述技術(shù)方案可以采用下述一種或幾種方式進(jìn)行改進(jìn)(一)第I步中的發(fā)酵處理時間為3h IOh ; (二)第4步的第二種方式中，接種的微生物為耐黃姜皂苷且產(chǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物的菌株，如產(chǎn)Y-亞油酸的小克銀漢霉，或者為將菌體本身作為高蛋白飼料的產(chǎn)朊假絲酵母，或者產(chǎn)多殺菌素的刺糖多胞菌等；(三)第4步的第一種方式中，微濾裝置的孔徑為O. 10 O. 45 μ m,納濾裝置孔徑為I 2nm，納濾膜是截留分子量為200 500道爾頓的有機(jī)膜。(四)第5步中，對于第4步中第一種方式得到濃縮的黃姜皂苷溶液，可直接水解含黃姜皂苷溶液，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后獲得黃姜皂素粗品；對于第4步中第二種方式得到的黃姜皂苷溶液，先采用減壓濃縮(減壓濃縮條件為60 90°C，真空度-O.1 O. 08Mpa)后，得到濃縮的黃姜皂苷溶液，再對其進(jìn)行水解成為黃姜皂素，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后獲得黃姜皂素粗品。
上述技術(shù)方案可以采用下述方式進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)所述黃姜原料為鮮黃姜或黃姜干粉，鮮黃姜經(jīng)洗凈去雜后，在溫度120 130°C、壓力O.1 O. 2MPa條件下，蒸汽爆破15 20min，冷卻至室溫后使用；黃姜干粉由黃姜塊根干燥后粉碎至30目 100目得到，或進(jìn)一步采用與鮮黃姜相同條件的爆破處理后得到。對于原料為鮮黃姜時，上述第2步中，按每千克鮮黃姜加入2萬 3. 3萬單位⑶液態(tài)α -淀粉酶，按每千克鮮黃姜加入2萬 3. 3萬單位(U)液態(tài)糖化酶。
本發(fā)明方法第5步中水解可優(yōu)選下述二種方式(一)在黃姜皂苷溶液中，按照 10 15U/L加入薯蕷糖苷酶，在30 40°C條件下攪拌30 40min，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后得到黃姜皂素粗品；(二)向濃縮黃姜皂苷溶液中加入硫酸，使硫酸終濃度為O. 75 1. 50mol/L，在100 104°C條件下酸解2 4h，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后得黃姜皂素粗品。
以上所有步驟中用到固液分離均采用板框過濾或離心分離。
第6步中的有機(jī)溶劑可采用石油醚、汽油、乙酸乙酯中的任何一種。
本發(fā)明突破現(xiàn)有工藝瓶頸，使用微生物發(fā)酵方法替代處理時間長且成本高的復(fù)合酶方法，處理黃姜原料的微生物是分泌纖維素酶、果膠酶、半 纖維素酶、木聚糖酶活力高且淀粉酶活力很低的細(xì)菌或真菌高效預(yù)處理黃姜原料，使存在于植物組織中被纖維素、果膠質(zhì)、淀粉等包裹的黃姜皂苷充分釋放到溶液中。在雙酶法后固液分離所得的糖化液中，再先后采用微濾和納濾膜分離分別得到含水解糖或黃姜皂苷的溶液；或接種耐黃姜皂苷且產(chǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物的菌株如產(chǎn)Y-亞油酸的小克銀漢霉、將菌體本身作為高蛋白飼料的產(chǎn)朊假絲酵母等，通過發(fā)酵后固液分離，即可將菌體及黃姜皂苷溶液分開，分別得到富含胞內(nèi)產(chǎn)物的菌體和富含黃姜皂苷的溶液兩種粗產(chǎn)品，這種方法可減少膜分離設(shè)備投資及生產(chǎn)成本；本發(fā)明還可通過在黃姜原料制成漿液前利用蒸汽爆破處理，進(jìn)一步提高黃姜皂素的收率、降低生產(chǎn)成本，同時縮短生產(chǎn)時間。本發(fā)明方法完全克服了以往專利存在的諸多不足，真正實(shí)現(xiàn)了黃姜皂素的清潔生產(chǎn)和高值化綜合利用，并易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，為黃姜產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說明。在此需要說明的是，對于這些實(shí)施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組口 ο
首先說明以下各實(shí)施例所用的測量方法
(I)有機(jī)酸的定量測定方法采用高效液相色譜法，單位g/L，參考0h，H.，Wee, Y. J. , Yun, J. S. , Han, S. H. , Jung, S. ff. , Ryu, H. ff. , 2005. Lactic acid production from agricultural resources as cheap raw materials. Bioresour. Technol. 96 1492-1498.及 Meynial-Salles,1., Dorotyn, S. , Soucaille, P.A. new process for thecontinuous production of succinic acid from glucose at high yield,titer,and productivity[J]. Biotechnology and Bioengineering. 208,99(1) 12.
(2)還原糖的定量測定方法采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)，單位g/L，參考 Miller,G. L. ,1959. Use of dinitros alicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem 31 :426-429.
(3)黃姜皂素的定量測定方法高效液相色譜法，色譜條件為=C18反相柱 (syncronis C18 250X4. 6mm),檢測波長204nm,流動相為純甲醇，流速lml/min,進(jìn)樣量 10 μ L0
實(shí)施例1包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
500克黃姜塊根干燥后粉碎至100目，在溫度120 130°C、壓力0.1 0. 2MPa條件下，蒸汽爆破15min,冷卻至室溫；
2.微生物處理釋放黃姜皂苷步驟
上述黃姜干粉按照黃姜干粉水=I 5(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼尤?0%種子液，于PH值6. O、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵處理IOh后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)纖維素酶、果膠酶酶系的菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度37°C條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到種子液；所述能產(chǎn)纖維素酶、果膠酶組成的酶系的菌種是地衣芽孢桿菌Hg-1 ；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并從發(fā)酵液的固體顆粒中進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后向其中加入3萬單位α -淀粉酶，在 pH值7. O、溫度90°C條件下液化5minmin,冷卻至60°C以下；再加入3萬液態(tài)糖化酶,在pH 值4. O、溫度60°C條件下糖化6h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟。
步驟三中糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)玫浇?jīng)微生物及雙酶法處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到其葡萄糖濃度為59g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟。
上述含有大量水溶性黃姜皂苷和糖分的混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為Inm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869. 05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.水解含黃姜皂苷的濃縮液獲得黃姜皂素粗品步驟。
本實(shí)例中，上述濃縮的黃姜皂苷溶液中，加入一定濃度硫酸，使硫酸終濃度為1.5mol/L，在100°C條件下酸解2h，水洗除去液體部分即得黃姜皂素粗品。
所述黃姜皂素粗品再以石油醚混合O. 3%活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取4h，趁熱除去活性炭，在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)酒精
將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為含糖量150g/L加(15%左右淀粉漿)入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比17%的種子液，于pH值4. 5、 溫度28. 5 °C條件下，靜置發(fā)酵84h。
所述種子液按如下方法制備取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%滅菌待用的糖水中，38°C水浴中活化50min,即可用來接種。
生產(chǎn)結(jié)果每100克干黃姜生產(chǎn)出皂素2. 17克，酒精25. 97g。
實(shí)施例2包括下列步驟
1.黃姜原料 預(yù)處理步驟
1000克黃姜塊根干燥后，粉碎至60目。
2.微生物處理釋放黃姜皂苷步驟
按照黃姜干粉水=I 10(w/v)加水混合均勻；冷卻后接種10%種子液，于pH 值6. O、溫度37°C條件下,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,發(fā)酵處理6h后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將能產(chǎn)纖維素酶、半纖維素、果膠酶組成的酶系的兩種菌種分別接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、 溫度37°C條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到兩種種子液；所述能產(chǎn)纖維素酶、半纖維素、果膠酶酶系的菌種是地衣芽孢桿菌Hg-1和Hg-6，兩種菌株種子液同時添加5%復(fù)合處理；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后加入8萬單位α -淀粉酶，在pH值 4. O、溫度91°C條件下液化20min，冷卻至60°C以下；再按每千克黃姜干粉加入8萬單位糖化酶，在pH值7. O、溫度60°C條件下糖化16h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)?得到經(jīng)微生物及雙酶法處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到混合液中葡萄糖濃度為62g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟。
步驟4中混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為1. 5nm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869. 05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷的溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述濃縮的黃姜皂苷溶液中，加入一定濃度硫酸，使硫酸終濃度為l.Omol/L，在 102°C條件下酸解3h，水洗除去液體部分即得黃姜皂素粗品。
所述黃姜皂素粗品再以石油醚混合O. 5%的活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取4h,趁熱除去活性炭,在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)酒精
通過添加葡萄糖將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為150g/L(15%左右淀粉漿)，加入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比15%的種子液，于PH值4. 5、溫度28. 5 °C條件下，靜置發(fā)酵84h。
所述種子液按如下方法制備取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%滅菌待用的糖水中，38°C水浴中活化50min,即可用來接種。
生產(chǎn)結(jié)果每100克干黃姜生產(chǎn)出皂素2. 20克，酒精26. 84g。
實(shí)施例3包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
鮮黃姜洗凈去雜后，取20千克在溫度120 130°C、壓力O.1 O. 2MPa條件下，蒸汽爆破20min，冷卻至室溫。
2.微生物處理釋放黃姜皂苷步驟
將經(jīng)過預(yù)處理后的黃姜塊莖粉碎至漿液，按照鮮黃姜水=I 2(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼尤?0%種子液，于pH值6.0、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵處理IOh后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或木聚糖酶的菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度37`°C 條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到種子液；所述能產(chǎn)纖維素酶、果膠酶等組成的酶系的菌種是地衣芽孢桿菌Hg-5 ；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟。
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后加入40萬單位α -淀粉酶，在pH值 6. 2、溫度92°C條件下液化15min 20min,冷卻至60°C以下；再加入66萬單位糖化酶,在 pH值4. 2、溫度60°C條件下糖化24h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(板框過濾)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)玫浇?jīng)微生物及雙酶法發(fā)酵處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度為60g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟。
步驟4混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，清夜再通過孔徑為2nm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869. 05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷的溶液獲得黃姜皂素粗品
上述納濾截留的黃姜皂苷濃縮液中，每升加入15U薯蕷皂苷酶，在pH值為6. O、溫度40°C條件下攪拌40min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以汽油混合O. 8%活性炭為提取劑，在60°C溫度下回流提取4h， 趁熱過濾活性炭，在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑汽油循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)酒精
通過添加葡萄糖將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為含糖量150g/L(15%左右淀粉漿)入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比17%的種子液， 于pH值4. 5、溫度28. 5 °C條件下，靜置發(fā)酵84h。
所述種子液按如下方法制備取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%滅菌待用的糖水中，38°C水浴中活化50min,即可用來接種。
生產(chǎn)結(jié)果每100克鮮黃姜生產(chǎn)出皂素O. 75克，酒精25. 97g。
實(shí)施例4包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
7. 5千克黃姜塊根干燥后，粉碎至30目，在溫度120 130°C、壓力O.1 O. 2MPa 條件下，蒸汽爆破20min,冷卻至室溫。
2.微生物處理釋放黃姜皂苷步驟
經(jīng)過預(yù)處理的黃姜原料按照黃姜干粉水=1: 7(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼尤?10%種子液，于pH值6. O、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵處理4h后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將能產(chǎn)纖維素酶、果膠酶組成的酶系的兩種菌種分別接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度37°C條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到兩種種子液；所述產(chǎn)纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或木聚糖酶的菌種分別是地衣芽孢桿菌Hg-1和Hg-5，兩種菌株種子液同時添加5%復(fù)合處理；
3.雙酶法處理上 述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后，加入75萬單位α -淀粉酶，在pH 值6. 2、溫度92°C條件下液化30min，冷卻至60°C以下；再加入75萬單位糖化酶，在pH值 4. O、溫度60°C條件下糖化6h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(板框過濾)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)玫浇?jīng)微生物及雙酶法預(yù)處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度62g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟
步驟4混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為Inm納濾裝置，截留分子量較大(M = 869.05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述濃縮的黃姜皂苷溶液中，每升加入IOU薯蕷皂苷酶，在pH值為5. O、溫度37°C 條件下攪拌30min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗品再以乙酸乙酯混合O. 5%活性炭為提取劑，在80°C溫度下回流提取 4h，趁熱除去活性炭，在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑乙酸乙酯循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)酒精
將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為含糖量150g/L(15%左右淀粉漿)加入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比15%的種子液，于pH值4. 5、 溫度28. 5 °C條件下，靜置發(fā)酵84h。
所述種子液按如下方法制備取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%滅菌待用的糖水中，38°C水浴中活化50min,即可用來接種。
生產(chǎn)結(jié)果每100克干 黃姜生產(chǎn)出皂素2. 10克，酒精26. 84g。
實(shí)施例5包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
鮮黃姜洗凈去雜后，取1500克在溫度120 130°C、壓力O.1 O. 2MPa條件下，蒸汽爆破15min,冷卻至室溫。
2.微生物處理釋放皂苷步驟
將上述經(jīng)過預(yù)處理的黃姜塊莖粉碎至漿液，按照鮮黃姜水=I 2(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼臃N10%種子液,于pH值6. O、溫度37°C條件下,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,預(yù)處理4h后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將能產(chǎn)纖維素酶、果膠酶組成酶系的菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度37°C條件下攪拌， 攪拌速度120rpm，時間10h，得到種子液；所述能產(chǎn)纖維素酶、果膠酶組成酶系的菌種是地衣芽孢桿菌Hg-1 ；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟。
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后加入3萬單位α -淀粉酶，在pH值 6. 2、溫度90°C條件下液化15min，冷卻至60°C以下；再加入4. 5萬單位糖化酶，在pH值4. 2、 溫度60°C條件下糖化20h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)玫浇?jīng)微生物及雙酶法預(yù)處理形成的含有大量水溶性黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng) SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度為60g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟。
配制生產(chǎn)Y-亞油酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，送入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比10%的種子液，于自然pH值、溫度28°C、攪拌速度ISOrpm條件下培養(yǎng)3天，然后在溫度20°C攪拌速度ISOrpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天。
所述種子液按如下方法制備取PDA固體培養(yǎng)上生長至對數(shù)期的小克銀漢霉與帶玻璃珠的無菌水在無菌條件下混合,在溫度28 °C條件下攪拌，攪拌速度150rpm,時間 20min,得到孢子懸液即為生產(chǎn)Y -亞油酸的種子液。
生產(chǎn)Y -亞油酸的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為還原糖 100g/L ;每升黃姜酶解糖液中添加 O. 3g MgSO4 ·7Η20，2gKH2P04，Ig酵母膏，3g NH4NO3, 20mg Fe2+, 20mg Ca2+, 20mg Cu2+, 20mgZn2+, pH5. 0 6. 0。
發(fā)酵完畢后，離心或者抽濾發(fā)酵液，即可得到小克銀漢霉菌體及含黃姜皂苷的發(fā)酵液兩種粗廣品；
Y-亞油酸提取將小克銀漢霉菌體烘干后磨碎，按照小克銀漢霉菌體質(zhì)量石油醚體積=1:1萃取40min,在5000rpm條件下離心IOmin,上清石油醚相 即為Y -亞油酸粗提液，在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到Y(jié)-亞油酸粗油。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述含黃姜皂苷的發(fā)酵液中，每升加入15U薯蕷皂苷酶，在pH值為5. 5、溫度37°C 條件下攪拌30min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合O. 5%活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取 4h,趁熱過濾活性炭,在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
生產(chǎn)結(jié)果每100克干黃姜生產(chǎn)出皂素2. 23g，Y -亞油酸1. 62g。
實(shí)施例6包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
500克黃姜塊根干燥后，粉碎至30目。
2.微生物處理釋放步驟
上述經(jīng)過預(yù)處理的黃姜干粉按照黃姜干粉水=1: 7(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼尤?0%種子液，于pH值6. O、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵處理4h后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)木聚糖酶、果膠酶組成酶系的兩種菌種分別接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度37°C條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到兩種種子液；所述產(chǎn)木聚糖酶、果膠酶組成的酶系的菌種分別是地衣芽孢桿菌Hg-2和Hg-3，兩種菌株種子液同時添加5%復(fù)合處理；
3.雙酶法處理釋放水解糖和黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，然后加入6萬單位α -淀粉酶，在pH值6. 2、溫度90 92°C條件下液化30min，冷卻至60°C以下；再加入10萬單位糖化酶，在pH值4. 2、溫度60°C條件下糖化12h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)玫浇?jīng)微生物及雙酶法預(yù)處理形成的含有大量水溶性黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng) SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度為62g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟
步驟4混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為2nm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869.05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述納濾截留的黃姜皂苷濃縮液中，每升加入IOU薯蕷皂苷酶，在pH值為6. O、溫度40°C條件下攪拌40min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取4h，趁熱過濾活性炭，在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸
配制生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，送入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比10%的種子液，于pH值7. O、溫度33°C條件下，按照速度lL/min通入 CO2并攪拌,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,當(dāng)發(fā)酵液中還原糖濃度小于2g/L時發(fā)酵結(jié)束。
所述種子液按如下方法制備每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨15g、酵母粉7. 5g,混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)琥珀酸菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值7、溫度50°C條件下攪拌，攪拌速度200rpm，時間18h，得到種子液；所述產(chǎn)琥珀酸菌種是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌FZ53。
生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為還原糖 150g/L ;每升黃姜酶解糖液中添加酵母粉5g、蛋白胨10g、K2HP042g，調(diào)節(jié)pH值至7. O ;
生產(chǎn)結(jié)果每100克鮮黃姜生產(chǎn)出皂素O. 76克，琥珀酸24. 26g。
實(shí)施例7包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理步驟
1000克黃姜塊根干燥后，粉碎至100目，在溫度120 130°C、壓力O.1 O. 2MPa 條件下，蒸汽爆破20min,冷卻至室溫。
2.微生物處理釋放皂苷步驟
上述經(jīng)過預(yù)處理的 黃姜干粉按照黃姜干粉水=1: 6(w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼臃N10%種子液，于自然pH值、溫度25°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，預(yù)處理IOh后結(jié)束。
所述種子液是富含孢子的懸液，先稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水IOOOml 煮沸半個小時，紗布過濾，再加10 20g葡萄糖和17 20g瓊脂，充分溶解后滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶組成的酶系的菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在溫度25°C條件下靜置培養(yǎng)時間24 48h，形成大量菌絲體后加入無菌水振蕩得到種子液；所述產(chǎn)纖維素酶、果膠酶組成酶系的菌種是白腐真菌Hg-4 ；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，適當(dāng)冷卻后加入10萬單位α-淀粉酶，在pH值6.2、溫度90 92°C條件下液化15min 20min,冷卻至60°C以下；再加入8萬單位糖化酶， 在pH值4. 2、溫度60°C條件下糖化20h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)?得到經(jīng)微生物及雙酶法預(yù)處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度為65g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟
步驟4混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為Inm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869.05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述納濾截留的黃姜皂苷濃縮液中，每升加入15U薯蕷皂苷酶，在pH值為5. O、溫度37°C條件下攪拌30min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合O. 3%活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取 4h,趁熱過濾活性炭,在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸
配制生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，送入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比8%的種子液，于pH值5. 5、溫度30°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm，當(dāng)發(fā)酵液中還原糖濃度小于3g/L時，發(fā)酵結(jié)束。
所述種子液按如下方法制備每升水加入葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)乳酸菌種接種于無菌種子培養(yǎng)基，在pH值5. 5、溫度30°C條件下攪拌，攪拌速度50rpm，時間10h，得到種子液；所述產(chǎn)乳酸菌種是鼠李糖乳桿菌L. rhamnosus HG09F-27。
生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為將上述黃姜淀粉糖化液糖濃度調(diào)整為還原糖 160g/L ;每升黃姜酶解糖液中添加酵母粉5g、蛋白胨10g、K2HP042g,調(diào)節(jié)pH值至5. 5 ;
生產(chǎn)結(jié)果每100克干黃姜生產(chǎn)出皂素2. 13克，乳酸34. 56g。
實(shí)施例8包括下列步驟
1.黃姜原料預(yù)處理 步驟
鮮黃姜洗凈去雜后，取2000克在溫度120 130°C、壓力0.1 0. 2MPa條件下， 蒸汽爆破18min,冷卻至室溫,粉碎至衆(zhòng)。
2.微生物處理釋放步驟
上述經(jīng)過預(yù)處理的黃姜塊莖按照鮮黃姜水=1:1 (w/v)加水?dāng)嚢杈鶆颍蝗缓蠼臃N10%種子液，于pH值6. O、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵處理4h后結(jié)束。
所述種子液是普通的LB培養(yǎng)基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g， 調(diào)節(jié)PH值至7. 0，混合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成的酶系的兩種菌種分別接種于無菌種子培養(yǎng)基，在pH值7、 溫度37°C條件下攪拌，攪拌速度120rpm，時間10h，得到兩種種子液；所述產(chǎn)纖維素酶、果膠酶的組成的酶系的菌種分別是地衣芽孢桿菌Hg-1和Hg-6，兩種菌株種子液同時添加5%復(fù)合處理；
3.雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并進(jìn)一步釋放黃姜皂苷步驟
上述發(fā)酵液置于高溫下滅活菌種，然后加入5萬單位α -淀粉酶，在pH值6. 2、溫度92°C條件下液化5min，冷卻至60°C以下；再加入5萬單位糖化酶，在pH值4. 2、溫度60°C 條件下糖化24h，得到黃姜糖化醪。
4.固液分離獲得含黃姜皂苷和水解糖的混合液步驟
上述糖化醪再通過固液分離(5000rpm離心8min)去除其中未被酶解的固體殘?jiān)?得到經(jīng)微生物及雙酶法預(yù)處理形成的含有大量黃姜皂苷和糖分的混合液，經(jīng)SBA-生物傳感儀測定得到混合液葡萄糖濃度為65g/L。
5.糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟
步驟4混合液進(jìn)一步通過微濾得到清液，再通過孔徑為1. 5nm的納濾裝置，截留分子量較大(M = 869.05)的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到水解糖溶液和濃縮的黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品。
6.酶法或酸法水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品步驟
上述納濾截留的黃姜皂苷濃縮液中，每升加入15U薯蕷皂苷酶，在pH值為5. O、溫度37°C條件下攪拌30min，除去上清即得黃姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合O. 5%活性炭為提取劑，在85°C溫度下回流提取 4h,趁熱過濾活性炭,在壓力O. 01 O. 05Mpa、溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑石油醚循環(huán)利用，并得到白色黃姜皂素固體。
7.利用黃姜淀粉糖化液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸
配制產(chǎn)朊假絲酵母生長發(fā)酵培養(yǎng)基，送入發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后，向發(fā)酵罐中接入體積比10 %的種子液，于pH值6. O、溫度37°C條件下，攪拌轉(zhuǎn)速 ISOrpm,當(dāng)發(fā)酵液中還原糖濃度為2g/L時，發(fā)酵結(jié)束。
所述種子液按如下方法制備每升水加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉IOgJg 合成種子培養(yǎng)基并滅菌，冷卻至室溫，得到無菌種子培養(yǎng)基；將產(chǎn)朊假絲酵母接種于無菌種子培養(yǎng)基，在PH值6. O、溫度30°C條件下攪拌，攪拌速度180rpm，時間12h，得到種子液。
生長菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為在上述黃姜淀粉糖化液糖中按每添加酵母粉 10g、蛋白胨21.3g，調(diào)節(jié)pH值至6.0 ；
生產(chǎn)結(jié)果每100克鮮黃姜生產(chǎn)出皂素O. 77克，產(chǎn)軟假絲酵母菌體干重1. 2克。
以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步驟第I步微生物處理釋放黃姜皂苷步驟按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1: 5 1: 10混合均勻制成漿液，在漿液中接種微生物，微生物能夠分泌纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶和木聚糖酶中的任二種或二種以上，但分泌淀粉酶能力小于或者等于O.1U每毫升發(fā)酵液，再進(jìn)行發(fā)酵處理，得到含黃姜皂苷和淀粉的微生物發(fā)酵液；第2步雙酶法處理上述微生物發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，并從發(fā)酵液的固體顆粒中進(jìn)一步釋放黃姜阜苷步驟向上述發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入6萬 10萬單位⑶α-淀粉酶，在pH值 4. O 7. O、溫度90 92°C條件下液化5min 30min，發(fā)酵液中微生物此時已被高溫滅活， 不會利用水解糖；將高溫發(fā)酵液冷卻至60°C以下后，再按黃姜干重每千克加入6萬 10萬單位(U)糖化酶，在pH4.0 7.0、溫度40 601條件下糖化611 2411，得到含有大量黃姜皂苷和水解糖的黃姜糖化醪；第3步固液分離黃姜糖化醪步驟通過固液分離去除上述黃姜糖化醪中未被酶解的固體殘?jiān)蜏缁畹奈⑸铮玫浇?jīng)第 2步處理后形成的含有水溶性黃姜皂苷和水解糖的混合液，即糖化液；第4步糖化液中黃姜皂苷和水解糖的分離步驟通過以下兩種方式分離上述糖化液中含有的黃姜皂苷和水解糖第一種方式通過微濾得到清液，再通過納濾裝置，截留分子量較大的黃姜皂苷，濾過分子量較小的水解糖，分別得到濃縮的黃姜皂苷溶液和水解糖溶液兩種粗產(chǎn)品；第二種方式以上述糖化液為碳源，配制培養(yǎng)基，滅菌后接種耐黃姜皂苷且產(chǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物的菌株，發(fā)酵處理后，離心發(fā)酵液，即將菌體及黃姜皂苷溶液分開，分別得到富含胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物的菌體和黃姜皂苷溶液兩種粗產(chǎn)品；第5步水解含黃姜皂苷溶液獲得黃姜皂素粗品；第6步所述黃姜皂素粗品再經(jīng)混合有活性炭的有機(jī)溶劑提取即得到黃姜皂素，所述活性炭的質(zhì)量百分比濃度為O. 3 O. 8%。以上所有步驟中用到固液分離均采用板框過濾或離心分離。第6步中的有機(jī)溶劑可采用石油醚、汽油、乙酸乙酯中的任何一種。
2.如權(quán)利要求1所述的利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，第I步中的發(fā)酵處理時間為3h IOh。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，第4步的第二種方式中，為產(chǎn)Y-亞油酸的小克銀漢霉、或者為將菌體本身作為高蛋白飼料的產(chǎn)朊假絲酵母、或者產(chǎn)多殺菌素的刺糖多胞菌等。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，第4步中，微濾裝置的孔徑為O. 10 O. 45 μ m,納濾裝置孔徑為O. 5 Inm,納濾膜是截留分子量為100 500道爾頓的有機(jī)膜。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，第5步包括二種方式，第一種方式對于第4步中的第一種方式得到濃縮的黃姜皂苷溶液，直接水解含黃姜皂苷溶液，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后獲得黃姜皂素粗品；第二種方式對于第4步中第二種方式得到的黃姜皂苷溶液，先采用減壓濃縮后，得到濃縮的黃姜皂苷溶液，再水解含黃姜皂苷溶液，黃姜皂素不溶于水而沉淀，固液分離后獲得黃姜皂素粗品。
6.如權(quán)利要求5所述的利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，所述黃姜原料為鮮黃姜或黃姜干粉，鮮黃姜經(jīng)洗凈去雜后，在溫度120 130°C、壓力O.1 .0.2MPa條件下，蒸汽爆破15 20min，冷卻至室溫后使用；黃姜干粉由黃姜塊根干燥后粉碎至30目 100目得到，或進(jìn)一步采用與鮮黃姜相同條件的爆破處理后得到。
7.如權(quán)利要求6所述的利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，對于原料為鮮黃姜時，第2步中，按每千克鮮黃姜加入2萬 3. 3萬單位α -淀粉酶，按每千克鮮黃姜加入2萬 3. 3萬單位糖化酶。
8.如權(quán)利要求5所述的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于， 第5步的第一種方式中，在黃姜皂苷溶液中，按照10 15U/L加入薯蕷糖苷酶，在30 40°C 條件下攪拌30 40min，得到黃姜皂素粗品。
9.如權(quán)利要求5所述的一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于，第5步的第二種方式中，向濃縮黃姜皂苷溶液中加入硫酸，使硫酸終濃度為O. 75 .1.50mol/L，在100 104°C條件下酸解2 4h，即得黃姜皂素粗品。
全文摘要
一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，屬于生物工程領(lǐng)域，解決現(xiàn)有黃姜產(chǎn)業(yè)廢水廢渣排放量大、不能有效利用黃姜淀粉的問題。本發(fā)明先微生物處理釋放黃姜皂苷，得到含黃姜皂苷和淀粉的發(fā)酵液；然后雙酶法處理上述發(fā)酵液中淀粉得到水解糖，進(jìn)一步釋放黃姜皂苷；固液分離黃姜糖化醪；再先后采用微濾和納濾膜分離分別富集水解糖和黃姜皂苷，或者通過特定微生物發(fā)酵分離得到胞內(nèi)產(chǎn)物和黃姜皂苷，濃縮的黃姜皂苷溶液經(jīng)糖苷酶或少量酸水解及少量有機(jī)溶劑提取即可得到黃姜皂素。該方法黃姜皂素收率高(90～95％)，生產(chǎn)過程廢水量少且污染程度低，且微生物處理成本低、用時短、黃姜淀粉回收充分，在黃姜產(chǎn)業(yè)中具有極大的工業(yè)應(yīng)用推廣價值。
文檔編號C12P33/20GK103060416SQ201210559060
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者余龍江, 魏蜜, 余潘潘, 敖明章, 金文聞 申請人:華中科技大學(xué)