專利名稱：降解臍橙囊衣微生物、含有其的酶制劑及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體而言，涉及一種降解臍橙囊衣微生物、含有其的酶制劑及應用。
背景技術：
我國柑橘加工長期沿襲著人工剝皮和酸堿脫囊衣等傳統(tǒng)工藝生產。現有酸堿法脫囊衣的酸堿處理法主要有經典酸堿二步法、改良重酸二步法、磷酸鹽NaOH —步法，以及EDTA或Na2-EDTA (乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉)為助 劑的低堿去囊衣法。人工去皮和酸堿脫囊衣工藝存在勞動密集、生產效率低、產品質量不穩(wěn)定等問題。目前工業(yè)化罐頭生產脫囊衣耗水量大，每噸產品耗水量達6(T80噸，不僅增加產品成本，而且加劇了飲用水資源的短缺。同時，因大量使用堿，產生大量的工業(yè)堿液廢水，增加了產品的生產成本，也污染環(huán)境，影響了產品的安全性，容易遭遇技術壁壘和綠色壁壘，削弱了我國柑橘罐頭工業(yè)在國際市場的競爭優(yōu)勢。同時，在柑橘加工生產中產生了約占柑橘加工量30%左右的皮渣，通常都被丟棄掉，不僅造成資源浪費，也給環(huán)境帶來了污染。臍橙加工中脫囊衣工藝是其主要技術難點之一。目前橙汁胞的生產技術主要采用傳統(tǒng)柑橘罐頭酸堿處理的工藝，存在人工剝皮、分瓣，生產效率低的問題；酸堿囊衣用水量大，環(huán)境污染嚴重，產品安全性低；由于柑橘皮與臍橙皮結構的差異，導致現有的柑橘酶法去囊衣技術不適合于臍橙橙汁胞的加工。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種降解臍橙囊衣微生物、含有其的酶制劑及應用，以解決現有技術中酸堿脫臍橙囊衣工藝生產效率低、產品質量不穩(wěn)定并且存在環(huán)境及食品安全的技術問題。根據本發(fā)明的一個方面，提供一種降解臍橙囊衣微生物。該微生物的保藏名稱為黑曲霉C-2 (Aspergillus sp. C_2)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCN0:M2012160o根據本發(fā)明的另一個方面，提供一種降解臍橙囊衣微生物在制備降解臍橙囊衣酶制劑中的應用。根據本發(fā)明的再一個方面，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑。該降解臍橙囊衣酶制劑采用上述降解臍橙囊衣微生物制得。進一步地，采用降解臍橙囊衣微生物經菌種發(fā)酵培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制得。進一步地，液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養(yǎng)的步驟。進一步地，該酶制劑包括將酶制劑經過超濾、濃縮制得濃縮酶制劑，或將酶制劑制備成粉劑或顆粒劑。
根據本發(fā)明的又一個方面，提供一種上述降解臍橙囊衣酶制劑在臍橙、柑橘脫囊衣上的應用。進一步地，包括以下步驟將酶制劑稀釋到酶活為8 X IO3 10 X 103u/g :將稀釋后的酶制劑與削皮臍橙以質量比為3 1的比例混合，45 50°C保溫9(Tl20min傳統(tǒng)酸堿脫囊衣工藝存在重金屬殘留等不安全因素，而采用本發(fā)明的降解臍橙囊衣的微生物制備的酶制劑不涉及酸堿的大量使用，通過生物酶解作用進行臍橙囊衣的脫除，因此可大大提升生產效率、減少臍橙果破碎率、使產品質量穩(wěn)定，并且能夠降低生產成本，無殘留、綠色環(huán)保、安全性高、不污染環(huán)境。該酶制劑的使用簡單便捷，對臍橙囊衣作用高效、完全，分解徹底，且不損傷內部橙汁胞。降解臍橙囊衣酶制劑發(fā)酵產酶工藝簡單，并且能夠達到節(jié)能降耗、節(jié)約用水、保護環(huán)境、清潔生產的目標。
具體實施例方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發(fā)明。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣微生物。該微生物的保藏名稱為黑曲霉C-2(Aspergillus sp. C-2)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:M 2012160，保藏日為2012年5月7日。本發(fā)明的降解臍橙囊衣微生物是通過以下步驟篩選獲得的從腐爛臍橙表面、土壤等樣品中篩選目標菌株，然后經過紫外誘變后，通過反復的篩選獲得對臍橙囊衣具有高效降解作用的菌株。本發(fā)明的準用菌株經鑒定為黑曲霉C-2 (Aspergillus sp.C-2)，其主要生物學特征為在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d 5d，菌落蔓延迅速，初為白色，后變成褐色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2. 5 4.0 Pm。分生孢子頭球狀，直徑700 800 ym，褐黑色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。分生孢子梗自基質中伸出長約I 3mm,壁厚而光滑。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑。該酶制劑采用上述降解臍橙囊衣微生物制得。由于該降解臍橙囊衣酶制劑不涉及酸堿的大量使用，通過生物酶解作用進行臍橙囊衣的脫除，因此可大大提升生產效率、減少臍橙果破碎率、使產品質量穩(wěn)定，并且能夠降低生產成本，無殘留、綠色環(huán)保、安全性高、不污染環(huán)境。優(yōu)選地，該酶制劑采用上述降解臍橙囊衣微生物經液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制得。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑的制備方法。該制備方法包括采用上述黑曲霉C-2作為發(fā)酵菌株，經過液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備得到降解臍橙囊衣酶制劑。在臍橙囊衣的脫除過程中起主要作用的是該黑曲霉C-2及其代謝物，因為此制備也可以采用現有技術中的常規(guī)方法進行，優(yōu)選地，黑曲霉C-2經過液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備得到降解臍橙囊衣酶制劑，因為這些酶制劑的制備方法簡單，便于工業(yè)化生產，而且不會造成環(huán)境污染。優(yōu)選地，液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養(yǎng)的步驟，增加這些步驟可以使菌株的活性增強，有利于酶制劑的生產效率提高，以及在后續(xù)使用過程中使酶制劑保持較高的活性。
根據本發(fā)明一種典型的實施方式，活化包括將黑曲霉C-2接種于培養(yǎng)基中進行活化，培養(yǎng)基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化時間為I 2天。冷凍保藏的產酶黑曲霉C-2菌種細胞通過該活化程序，可使該微生物產酶的能力快速恢復正常。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，種子培養(yǎng)包括將活化的孢子懸浮液接種于種子液體培養(yǎng)基中，控制種子液體培養(yǎng)基的PH值為7. 0 7. 2，培養(yǎng)溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養(yǎng)12 16h，最終獲取一定數量和質量的純種子，可作為大規(guī)模發(fā)酵生產的菌種。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，液體深層發(fā)酵培養(yǎng)包括將經過種子培養(yǎng)的含黑曲霉C-2的種子液體培養(yǎng)基接種于發(fā)酵瓶中進行深層發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為12h內溫度為30°C，12h 后 28°C ；pH 值為 7. 0 7. 2 ;壓力位 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m, 12h后200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發(fā)酵時間108 120h，制得酶制劑。通過液體深層發(fā)酵能夠保證養(yǎng)分均勻分配和氧氣充足，具有發(fā)酵產酶生產周期短、產量高、效益大等優(yōu)點。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的步驟包括經過所述種子培養(yǎng)的含黑曲霉C-2的所述種子固體培養(yǎng)基接種入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)108h，得到黑曲霉C-2固態(tài)發(fā)酵曲，所述固態(tài)發(fā)酵曲通過低溫干燥及粉碎后制得所述酶制劑，或通過0. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得所述酶制劑。固態(tài)發(fā)酵模擬菌種自然生長環(huán)境，使微生物保持與自然界相似的生長狀態(tài)，發(fā)酵結束時，培養(yǎng)基是濕物料狀態(tài)，目的產物濃度高且提取工藝簡單。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，活化用的培養(yǎng)基為固體斜面培養(yǎng)基；制備孢子懸浮液的步驟包括采用無菌水洗下黑曲霉C-2的孢子，并稀釋至2 3X IO6個/mL制得孢子懸浮液，并將孢子懸浮液保存在4°C備用。優(yōu)選地，種子培養(yǎng)步驟中將孢子懸浮液按5%的接種量接種于種子液體培養(yǎng)基中；液體深層發(fā)酵培養(yǎng)步驟中將經過種子培養(yǎng)的含黑曲霉C-2的種子液體培養(yǎng)基按8% 10%的接種量接種于發(fā)酵瓶中進行深層發(fā)酵培養(yǎng)。此接種量既不會造成菌種的浪費，又有利于黑曲霉C-2的快速繁衍。優(yōu)選地，活化用的以臍橙囊衣粉為碳源的培養(yǎng)基包括如下含量的組分=(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉6g/L 10g/L和瓊脂15g/L 20g/L，并且活化用的培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的活化，因為以臍橙囊衣粉為碳源，冷凍保藏的產酶黑曲霉C-2菌種細胞通過該活化程序，可使該微生物產生臍橙囊衣降解酶的能力快速恢復正常。優(yōu)選地，種子液體培養(yǎng)用的以臍橙囊衣粉為碳源的培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且種子液體培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的培養(yǎng)，最終獲取一定數量和質量的純種子，可作為大規(guī)模發(fā)酵生產的菌種。并且液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的過程中也可采用此培養(yǎng)基進行。因為以臍橙囊衣粉為碳源，可使該微生物產生的臍橙囊衣降解酶保持高活力。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，步驟4)之后根據實際需要進一步包括將酶制劑經過超濾、濃縮制得濃縮酶制劑，或將酶制劑制備成粉劑或顆粒劑等，濃縮酶制劑方便使用，粉劑或顆粒劑等更便于保藏與運輸。通過本發(fā)明方法制備的酶制劑酶解效率較高；并且經過該方法制得的酶制劑在酶發(fā)酵液經過過濾除菌、超濾濃縮、防腐處理后室溫保存6個月后酶活仍然保持95%以上。
根據本發(fā)明一種典型的實施方式，上述降解臍橙囊衣酶制劑在臍橙、柑橘脫囊衣上的應用。優(yōu)選地，酶制劑的應用包括以下步驟酶制劑稀釋后與削皮臍橙于45飛(TC水浴保溫90 120min。根據本發(fā)明一種典型的實施方式，降解臍橙囊衣的具體方法為將削皮殘留囊衣的臍橙果球備用，將濃縮的發(fā)酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到45 °C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。本發(fā)明在對降解臍橙囊衣微生物菌株選育的同時對其發(fā)酵產酶的工藝進行了優(yōu)化，適合工業(yè)化大規(guī)模生產該酶制劑。
根據本發(fā)明的一種典型的實施方式，提供一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養(yǎng) 基。該培養(yǎng)基為以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源。 用作微生物活化時，優(yōu)選地包括如下含量的組分(NH4) 2S04 2g/L 2. 5g/L、MgS04
0.6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L lOg/L 和瓊脂15g/mL 20g/mL,并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養(yǎng)基。用于種子液態(tài)培養(yǎng)和深層液體發(fā)酵培養(yǎng)時，優(yōu)選地包括如下含量的組分。(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養(yǎng)基。下面將結合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。活化用的培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L 10g/L 和瓊脂 15g/L 20g/L,并且活化用的培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的活化。種子液體培養(yǎng)基和深層液體發(fā)酵培養(yǎng)包括如下含量的組分=(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L、K2HP04 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且種子液體培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的培養(yǎng)，并且液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的過程中也可以采用此培養(yǎng)基進行。實施例1本實施例考察液體深層發(fā)酵液中本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株CCTCCN0:M 2012160發(fā)酵液對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑活化培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO42g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、臍橙囊衣粉6g/L和瓊脂15g/L，并且活化用的培養(yǎng)基在121 °C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養(yǎng)基效果相似。種子液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L ;并且種子液體培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的培養(yǎng)，并且液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的過程中也可以采用此培養(yǎng)基進行。
步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養(yǎng)基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養(yǎng)基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 29°C，活化培養(yǎng)2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養(yǎng)將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于種子液體培養(yǎng)基中，控制種子培養(yǎng)基的pH值為7. 0 7. 2，種子培養(yǎng)時的溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養(yǎng)12 16h ;培養(yǎng)基中臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L。(3)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)后的種子黑曲霉C-2菌種按液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基8% 10%的接種量接種入發(fā)酵瓶中進行深層發(fā)酵培養(yǎng)，所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與所述種子液體培養(yǎng)基相同，發(fā)酵培養(yǎng)條件為12h內溫度為30°C，12h后28°C ；自動調節(jié) pH 7. 0 7. 2 ;罐壓 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m，12h 后 200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發(fā)酵時間108 120h。 全流程培養(yǎng)時間大約在10天，將液體深層發(fā)酵所得的酶液立即使用，將所述發(fā)酵所得到的酶液經過超濾濃縮得到濃縮酶液，或通過其他加工方式得到的不同的降解臍橙囊衣酶制劑，如粉劑或顆粒劑等，備用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將濃縮的發(fā)酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例2本實施例考察液體深層發(fā)酵液中本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株CCTCCN0:M 2012160發(fā)酵液對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑活化培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO42. 5g/L, MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、NaC12g/L、臍橙囊衣粉10g/L和瓊脂20g/L，并且活化用的培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養(yǎng)基效果相似。種子液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2. 5g/L、MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣20g/L ;并且種子液體培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的培養(yǎng)，并且液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的過程中也可以采用此培養(yǎng)基進行。步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養(yǎng)基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養(yǎng)基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在29°C 30°C，活化培養(yǎng)2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養(yǎng)將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于種子液體培養(yǎng)基中，控制種子培養(yǎng)基的pH值為7. 0 7. 2，種子培養(yǎng)時的溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養(yǎng)12 16h ;培養(yǎng)基中臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣20g/L。
(3)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)將上述培養(yǎng)后的種子黑曲霉C-2菌種按液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基8% 10%的接種量接種入發(fā)酵瓶中進行深層發(fā)酵培養(yǎng)，所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與所述種子液體培養(yǎng)基相同，發(fā)酵培養(yǎng)條件為12h內溫度為30°C，12h后28°C ;自動調節(jié) pH 7. 0 7. 2 ;罐壓 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m，12h 后 200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發(fā)酵時間108 120h。全流程培養(yǎng)時間大約在10天，將液體深層發(fā)酵所得的酶液立即使用，將所述發(fā)酵所得到的酶液經過超濾濃縮得到濃縮酶液，或通過其他加工方式得到的不同的降解臍橙囊衣酶制劑，如粉劑或顆粒劑等，備用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將濃縮的發(fā)酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑 可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例3本實施例考察固態(tài)發(fā)酵中本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160固態(tài)發(fā)酵曲對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發(fā)明的黑曲霉C-2固體曲活化培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO42. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41. 5g/L、NaCl1. 5g/L、臍橙囊衣粉8g/L和瓊脂18g/L，并且活化用的培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養(yǎng)基效果相似。種子液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41.5g/L、NaCl1. 5g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣18g/L ;并且種子液體培養(yǎng)基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養(yǎng)基適合用于黑曲霉C-2的培養(yǎng)，并且液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的過程中也可以采用此培養(yǎng)基進行。步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養(yǎng)基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養(yǎng)基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化培養(yǎng)2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養(yǎng)將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于滅菌的由麥麥麩95重量份、臍橙果渣或果皮粉180重量份、硫酸銨2重量份、硫酸鎂0. 5重量份、磷酸氫二鉀I重量份，以上各組分加入水拌勻并調節(jié)水分濕度為60%。(初始pH 6. 5)，30°C培養(yǎng)48h。(3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)將上述活化的黑曲霉C-2種子曲按10%接種量接入50kg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分與上述固態(tài)種子培養(yǎng)基組分相同，種子曲與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻后，30°C培養(yǎng)108h，得到黑曲霉C-2固態(tài)發(fā)酵曲，該固態(tài)發(fā)酵曲可以通過低溫干燥及粉碎后使用，也可通過0. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得液體酶液后使用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將上述低溫干燥、粉碎的黑曲霉C-2固態(tài)發(fā)酵曲12kg加入120kg的生理鹽水中，攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后得到橙汁胞，該黑曲霉C-2固態(tài)發(fā)酵曲可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例4本實施例考察液體深層發(fā)酵液中本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160發(fā)酵液對柑橘囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑制備過程同實施例1。雪峰蜜桔50kg，經過洗滌、熱湯后剝皮，分瓣并清除橘瓣上的脈絡，得到橘瓣約35kg備用。將濃縮的發(fā)酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾 層鍋汽浴升溫到400C，然后加入35kg去皮除脈絡橘瓣(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度40 45°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 lOOmin，得到全脫囊衣橘瓣，內胞破碎率低，并且保持了柑橘原有的風味及色澤。該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。對比例在本對比例中采用的是傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)基，考察液體深層發(fā)酵液中本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160發(fā)酵液對臍橙囊衣的降解效果。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)基配方稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水IOOOmL煮沸半個小時，紗布過濾，再加15g葡萄糖(活化15g瓊脂)，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝后121°C滅菌20分鐘。采用傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)基配方制備本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑的步驟與方法與實施例1相同。臍橙100kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約80kg含囊衣的臍橙果球，平均分為兩份備用。分別將不同培養(yǎng)基發(fā)酵濃縮得到的發(fā)酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min。通過實施例1到4及對比例的實驗結果可以看出，通過傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)基配方發(fā)酵液對臍橙囊衣的沒有觀察到降解效果，而通過本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基配方發(fā)酵液處理得到全脫囊衣的臍橙果球。通過對比試驗發(fā)現本發(fā)明培養(yǎng)基配方不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發(fā)酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業(yè)的附加值，有保護了環(huán)境，具有經濟和社會雙重意義。綜上，與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明的降解臍橙囊衣微生物酶制劑可工業(yè)化大規(guī)模生產，經過除菌、防腐及濃縮處理后，酶制劑在常溫保存6個月其酶活性保持95%以上，使用方便，生產成本低。2、該酶制劑對臍橙囊衣降解作用高效、完全，徹底分解，且不損傷內部橙汁胞，提高生產效率，降低勞動強度，降低生產成本。3、本發(fā)明與酸堿工藝相比，生物酶制劑降解囊衣后的營養(yǎng)成分被破壞及流失優(yōu)于傳統(tǒng)的酸堿法，其保持了臍橙原有的風味及色澤。4、避免了傳統(tǒng)酸堿工藝造成的重金屬等有害物質的殘留的食品質量安全技術壁壘和酸堿排放造成的環(huán)境污染，節(jié)約大量的水資源，實現了經濟效益、生態(tài)效益及社會效益的統(tǒng)一。
5、本發(fā)明培養(yǎng)基配方不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發(fā)酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業(yè)的附加值，有保護了環(huán)境，具有經濟和社會雙重意義。總體來說，本發(fā)明的黑曲霉C-2菌株及其發(fā)酵產酶具有生產成本小、使用方便、臍橙囊衣降解效果好等優(yōu)點，適合在全國柑橘生產企業(yè)大范圍推廣使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，提升食品質量安全，保持臍橙原有風味，促進臍橙精深加工發(fā)展等方面具有重要意義。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種降解臍橙囊衣微生物，其特征在于，所述微生物的保藏名稱為黑曲霉C-2，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCN0:M 2012160。
2.如權利要求1所述的降解臍橙囊衣微生物在制備降解臍橙囊衣酶制劑中的應用。
3.一種降解臍橙囊衣酶制劑，其特征在于，采用如權利要求1所述的降解臍橙囊衣微生物制得。
4.根據權利要求3所述的酶制劑，其特征在于，采用所述降解臍橙囊衣微生物經菌種發(fā)酵培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制得。
5.根據權利要求4所述的酶制劑，其特征在于，所述液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養(yǎng)的步驟。
6.根據權利要求5所述的酶制劑，其特征在于，進一步包括將所述酶制劑經過超濾、 濃縮制得濃縮酶制劑，或將所述酶制劑制備成粉劑或顆粒劑。
7.—種如權利要求3至6任一項所述的降解臍橙囊衣酶制劑在臍橙、柑橘脫囊衣上的應用。
8.根據權利要求7所述的酶制劑的應用，其特征在于，包括以下步驟將所述酶制劑稀釋到酶活為8 X 1O3 1OX 103u/g :將稀釋后的所述酶制劑與削皮臍橙以質量比為3 1的比例混合，45 50°C保溫9(Tl20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解臍橙囊衣微生物、含有其的酶制劑及應用。其中，該微生物的保藏名稱為黑曲霉C-2(Aspergillus sp.C-2)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M 2012160。采用本發(fā)明的微生物降解臍橙囊衣的微生物制備的酶制劑不涉及酸堿的大量使用，通過生物酶解作用進行臍橙囊衣的脫除，因此可大大提升生產效率、減少臍橙果破碎率、使產品質量穩(wěn)定，并且能夠降低生產成本，無殘留、綠色環(huán)保、安全性高、不污染環(huán)境。該酶制劑的使用簡單便捷，對臍橙囊衣作用高效、完全，分解徹底，且不損傷內部橙汁胞。
文檔編號C12R1/685GK102994400SQ20121055907
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權日2012年12月20日
發(fā)明者趙良忠, 尹樂斌, 李文, 伍桃英, 肖凱, 郭育齊, 周小虎, 蔣瓊華, 周曉潔 申請人:湖南李文食品有限公司