一種用于細胞共培養的生物反應器系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于細胞共培養的生物反應器系統。該生物反應器系統中含有兩種或兩種以上規格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規格載體包埋一種細胞，將包埋有不同種類細胞的不同規格載體在同一生物反應器中培養，從而在同一體系中實現了兩種或兩種以上細胞在三維生長條件下的動態共培養，在培養結束后，借助粒徑篩分系統分別獲得包埋在不同粒徑規格載體中的各種細胞。
【專利說明】—種用于細胞共培養的生物反應器系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞共培養領域，具體說涉及一種體外三維非接觸式共培養領域。
【背景技術】
[0002]隨著細胞生物學的發展，人們越來越認識到不同種類細胞間相互作用的重要性。細胞間相互作用包括由細胞間直接接觸以及細胞間通過化學信號配體、受體(可溶性因子)所產生的生物學效應。研究細胞間相互作用的傳統方法是細胞間直接接觸共培養，但這種方法的最大缺點是難以區別生物學效應的產生是由于細胞間直接接觸還是化學信號(可溶性因子)傳導所致，且在此體系中不同種類細胞相互混合，無法實現目的細胞的完全分離。針對此問題，有研究者發明了 Transwell insert技術[參考文獻:LeVisage, C;Dunham, B;Flint, P, et al..Coculture of mesenchymal stem cellsandrespiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratorymucosa, Tissue Engineering, 2004, 10:1426-1435],實現了兩種細胞之間的二維非接觸共培養，此體系可以僅通過可溶性因子來實現細胞間的相互作用，并且兩種細胞可徹底分離，但該技術的最大缺陷是無法提供能夠模擬細胞在體生長狀態的三維微環境，且只能實現兩種細胞之間的共培養，難以實現共培養規模的放大。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種用于細胞共培養的生物反應器系統，該生物反應器系統中含有兩種或三種以上規格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規格載體包埋一種細胞，不同粒徑規格載體中分別包埋不同種類細胞，將包埋有不同種類細胞的不同規格載體在同一生物反應器中培養，從而在同一體系中實現了兩種或三種以上細胞在三維生長條件下的動態共培養，在培養結束后，借助粒徑篩分系統分別獲得包埋在不同粒徑規格載體中的各種細胞。
[0004]該生物反應器系統中的包埋型載體粒徑規格在100 μ m到2000 μ m范圍內，各規格之間平均粒徑相差大于等于200 μ m,且每個規格的載體微球粒徑偏差±50 μ m之內。比如:五種粒徑規格分別為 150 ± 50 μ m，350 ± 50 μ m，550 ± 50 μ m，750 ± 50 μ m，950 ± 50 μ m 等。
[0005]其中，不同粒徑規格載體的制備可借助已授權專利[精密高壓脈沖靜電式微膠囊制備儀ZL200720014715.8]和[一種具有相同變化電場力的多通道高效電極ZL200710158289.X]來實現。
[0006]該生物反應器系統中的生物反應器可以是旋轉生物反應器、流化床或固定床型生物反應器、或攪拌式生物反應器。
[0007]該生物反應器系統中的包埋型載體為海藻酸鈉基的球形載體；
[0008]海藻酸鈉基包括海藻酸鈉，以及RGD、IKVAV、HGSR、PEG、膠原、透明質酸、硫酸軟骨素、魚精蛋白修飾的海藻酸鈉中的一種或二種以上，海藻酸鈉基與二價金屬離子形成的凝膠微球，即為球形載體；[0009]或，上述凝膠微球與聚陽離子靜電絡合形成的微膠囊，即為球形載體。
[0010]所述二價金屬離子為鈣離子、鋇離子、鋅離子中的一種或兩種以上；
[0011]所述聚陽離子為殼聚糖、聚賴氨酸、聚鳥氨酸及它們衍生物中的一種或兩種以上。
[0012]將細胞包埋在海藻酸鈉基球形載體中的方法是一種公知的技術，比如采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內部凝膠化、膜乳化/內部凝膠化、膜乳化/外部凝膠化、微通道陣列技術、震動噴嘴技術等均可以制備出本發明所述的海藻酸鈉基球形載體，為簡明起見，本發明對這些公知技術不作詳細描述。有關這些公知技術的詳細報道可參閱:
[0013]靜電液滴法[參閱文獻:HommelM, Sun AM, Goosen MFA.Dropletsgeneration.Canadian patent N0.1241598, 1988];
[0014]氣動液滴法[參閱文獻:MiyawakiO, Nakamura K, Yano T.Agric.Biol.Chem.1980，44:2865-2870];
[0015]乳化/內部凝膠化[參閱文獻:劉群，馬小軍，劉袖洞。一種乳化/內部凝膠化制備海藻酸鈣凝膠珠的方法。中國專利N0.ZLOl 109449.4];
[0016]膜乳化/內部凝膠化[參閱文獻:劉袖洞，馬小軍，劉群。一種制備海藻酸鈣凝膠珠的膜乳化/內部凝膠化耦合技術，中國專利N0.ZL01104365.2]；
[0017]乳化/ 外部凝膠化[參閱文獻:Lucinda-silva RM, Evangelista RC.J.Microencapsulation, 2003, 20:145-152]
[0018]膜乳化/外部凝膠化[參閱文獻:YouJO, Park SB, Park HY, Haam S，Chung CH, KimWS.J.Microencapsulatio n, 2001, 18:521-532]
[0019]海藻酸鈉微膠囊[參閱文獻:MaX, Vacek I, Sun A.Artif Cells BloodSubstitTmmobi I Biotechnol,1994，22:43-69;參閱文獻 2:Mcknight C.A., Ku A,GoosenM.F.A.，Sun D, Penney C.J BIOACT COMPAT POL, 1988，3:334-355]
[0020]微通道陣列技術[參閱文獻:Α.M.Chuah, T.Kuroiwa, 1.Kobayashi, etal.Preparation of uniformly sized alginate microspheres using the novelcombinedmethods of microchannel emulsification and external gelation.ColloidsandSurfaces a-Physicochemical and EngineeringAspects, 2009，351 (1-3):9-17]
[0021]震動噴嘴技術[參閱文獻:H.H.Lee, 0.J.Park, J.M.Park, etal.Continuousproduction of uniform calcium alginate beads by sound wave inducedvibration.Journal of Chemical Technology and Biotechnology,1996，67 (3):255-259]
[0022]該生物反應器系統用于一種或兩種以上基質細胞與目的細胞之間通過非直接接觸方式由化學信號傳遞進行相互作用的不同細胞組合，通過細胞組合間的三維共培養可以相互影響細胞的增殖、凋亡、分化、細胞外泌功能中的一種或二種以上。
[0023]上述基質細胞為對目的細胞定向分化、增殖、組織化或凋亡等多種行為具有調控作用的多來源體細胞、轉基因細胞或細胞株；
[0024]其中，多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指 導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群；[0025]上述目的細胞為多來源干細胞、體細胞、腫瘤細胞、轉基因細胞或細胞株；
[0026]其中，多來源干細胞包括胚胎肝細胞或成體干細胞，多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群。
[0027]上述基質細胞和目的細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、或異源異種細胞。
[0028]該生物反應器系統中的粒徑篩分系統可以是不同目數的篩網分離不同粒徑規格的載體，也可以通過流化床體系，實現不同粒徑規格載體的分離。
[0029]在完成細胞共培養后，可借助粒徑篩分系統實現不同粒徑規格微球載體的分離，從而實現不同種細胞的有效分離。其中粒徑篩分系統可以是不同目數的篩網分離不同粒徑規格的載體，也可以通過流化床體系實現不同粒徑規格載體的分離[參閱文獻:一種海藻酸鈣膠珠分級的方法，中國發明專利，200810013524.9]
[0030]由此可見，本發明具有如下優點:
[0031]1、提供不同種類細胞的非直接接觸空間；
[0032]2、實現不同種類細胞或組織均在三維環境中的生長；
[0033]3、不同細胞間通過化學信號傳遞產生生物學效應；
[0034]4、細胞間相互作用后產生的效應可以通過粒徑篩分體系實現作用后不同種類細胞的分離；
[0035]5、實際應用時易于規模放大與工程化；
[0036]6、對現有細胞培養微載體或微膠囊體系的生物反應器均適用本發明的生物反應器系統，無需特殊改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發明的結構示意圖，其中，A-D微球粒徑每組依次相差200微米。
【具體實施方式】 [0038]實施例1:考察軟骨細胞與骨髓間充質干細胞兩種細胞間的相互作用
[0039]I)從SD大鼠(4周齡)取得股骨和脛骨，用一次性注射器吸取無血清DMEM培養基沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞，經細胞密度梯度離心法分離純化，用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱內培養傳代，至第3代后，運用流式細胞儀檢測細胞表面標記物進行骨髓間充質干細胞的驗證；
[0040]2)從SD大鼠(4周齡)的股骨和脛骨頭表面獲取關節軟骨，剪碎后，用2g/L的胰蛋白酶消化5hr后，再按體積比1:10加入2.5g/L的II型膠原酶消化，獲取關節軟骨細胞，用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱內進行原代培養，并運用甲苯胺藍及蘇木精/伊紅染色進行關節軟骨細胞的驗證；
[0041]3)將關節軟骨細胞以IXlO6個/ml密度均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，
0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為350 μ m包埋有關節軟骨細胞的海藻酸鈣微球，再與0.05%聚賴氨酸水溶液反應10min成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內部液化，制備出內部為液體環境的包埋有關節軟骨細胞的海藻酸鈉微膠囊;
[0042]4)將第3代骨髓間充質干細胞以I X IO6個/ml密度共同均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為600 μ m包埋有骨髓間充質干細胞的海藻酸鈣微球，清洗后，將微球與步驟3)制備的包埋有關節軟骨細胞的海藻酸鈉微膠囊用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱內共培養；
[0043]5)培養5、10、15天后，用50目篩網將兩種微球分離，350微米包埋有軟骨細胞的微膠囊漏出，而600微米包埋有骨髓間充質干細胞的海藻酸鈣微球在篩網內，將篩網內的海藻酸鈣微球用55mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，釋放海藻酸鈣微球中的骨髓間充質干細胞，1000rpm離心5min收集骨髓間充質干細胞,備用；
[0044]6)運用阿利新藍比色法測定骨髓間充質干細胞氨基聚糖含量，具體操作如下:將回收的骨髓間充質干細胞用4°C預冷的PBS清洗；加入細胞裂解液，冰上裂解30min后，12000rpm離心5min ;吸取上清，加入PBS至Iml ;加入0.5ml5mg/L胰蛋白酶37°C水解24hr ；加入0.5ml5mg/L木瓜蛋白酶37°C水解24hr，備用；氨基聚糖標準曲線繪制:加入1ml濃度為1、5、10、15、20、25、35、50mg/L的標準硫酸軟骨素溶液，空白對照加入1ml去離子水，再加入1.5mll.4g/L的阿利新藍染液,混勻，IOmin后測定480nm的吸光度,繪制標準曲線；取樣品Iml,加入1.5mll.4g/L的阿利新藍染液,混勻，IOmin后測定480nm的吸光度,并通過標準曲線計算出樣品中氨基聚糖含量。結果提示氨基聚糖含量隨著培養時間的延長而增加，說明關節軟骨細胞可通過非直接接觸方式誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化。
[0045]實施例2:考察腫瘤細胞和成纖維細胞兩種細胞與血管內皮細胞間的相互作用
[0046]I)將人膠質瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF等比例以2 X IO6個/ml密度均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為200 μ m包埋 有人膠質瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈣微球，再與0.05% (g/ml)聚賴氨酸水溶液反應10min成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內部液化，制備出內部為液體環境的包埋有人膠質瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊；
[0047]2)將包埋有人臍靜脈內皮細胞ECV304以2X IO6個/ml密度共同均勻分散到1.5%海藻酸鈉溶液中，在0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為400μm包埋有人臍靜脈內皮細胞ECV304的海藻酸鈣微球，清洗后，與步驟I)制得的包埋有人膠質瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊，在含15%胎牛血清的RPMI1640細胞培養基中，于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱內共培養；
[0048]3)培養I天和5天后，用50目篩網將兩種微球分離，包埋有人膠質瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊從篩網漏出，包埋有人臍靜脈內皮細胞ECV304的海藻酸鈣微球留在篩網中，用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使海藻酸鈣微球液化，釋放海藻酸鈣微球中的人臍靜脈內皮細胞ECV304，1000rpm離心5min收集細胞ECV304，備用；
[0049]4)運用RT-PCR方法檢測人臍靜脈內皮細胞ECV304細胞周期素Cyclin E表達，具體操作如下:將回收的ECV304細胞 用PBS清洗，采用Trizol法提取總RNA ;按照試劑盒說明書進行反轉錄和PCR反應；上游引物:5，-CTG GAT GTT GAC TGC CTT GA-3’，下游引物:5’-CCG CTG CTCTGC TTC TTA C-3，;反應參數:95°C預變性 5min，95°C變性 40sec，53°C退火35sec，72°C延伸35sec，共30個循環，于72°C保溫IOmin終止反應；反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳并進行半定量分析。結果提示ECV304細胞Cyclin E表達上調,說明腫瘤細胞和成纖維細胞兩種細胞共培養可通過非直接接觸方式促進內皮細胞的增殖。
[0050]實施例3:非接觸動態共培養誘導間充質干細胞體外三維定向分化為神經前體細胞
[0051]I)制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(HGSR)多肽修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的
0.1M2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸鈉溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和單一種類的多肽，室溫攪拌反應24小時。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1:20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2:1，多肽和海藻酸鈉質量比為1:1000。然后進行透析并冷凍干燥，從而得到多肽修飾的海藻酸鈉。之后，將上述三種多肽修飾的海藻酸鈉粉末分別溶解于生理鹽水中，溶液濃度均為1.5%(ff/V)，并配置體積比為1:1:1的三種多肽修飾海藻酸鈉的混合溶液，混合溶液終濃度仍為1.5%(ff/V)。
[0052]2)將人神經母細胞瘤細胞與1.5%(ff/V)的RGD單獨修飾海藻酸鈉溶液混合，調整細胞密度為2X IO6ceIls.ml/1，將該細胞懸液經過注射器泵滴入IOOmmol.L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到粒徑600微米的海藻酸鈣微膠珠。將海藻酸鈣微膠珠與0.05%(W/V)的聚賴氨酸反應成膜lOmi n，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊，再與0.15%(ff/V)海藻酸鈉溶液反應5min,最后用55mmol *L_1檸檬酸鈉液化5min,就得到了包埋有人神經母細胞瘤細胞的海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊。將此微膠囊使用DMEM/F12培養基洗滌3次，之后按1:10的體積比(微膠囊:培養液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，置于培養箱培養3天。
[0053]3)將第5代人臍帶間充質干細胞與上述1.5%(ff/V)含有三種多肽的海藻酸鈉混合溶液進行混合，調整細胞密度為4X106cells.mL_l，將該細胞懸液經過注射器泵滴入IOOmmol.L^1CaCl2溶液中鈣化20min，得到含有干細胞的粒徑300微米的海藻酸鈣微膠珠，使用DMEM/F12培養基洗滌3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，置于培養箱培養3天。
[0054]4)將含有神經母細胞瘤細胞的微膠囊以及含有干細胞的微膠珠分別接種在反應器主體中，二者接種體積比例為2:1，即兩種細胞接種數量之比為1:1。將兩種微球在流化床生物反應器中動態共培養4天。同時設立對照組，使用含有IOng.Hir1EGF和bFGF的DMEM/F12培養液誘導在微膠珠中三維培養的干細胞以及在培養瓶中二維培養的干細胞，培養4天。
[0055]5)動態共培養4天之后，用40目篩網將上述兩種微球分離，篩網內是包埋有人神經母細胞瘤細胞的海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊，而包埋有人臍帶間充質干細胞的海藻酸鈣微膠珠從篩網中漏出，收集漏出的海藻酸鈣微膠珠，培養液洗滌3次后用55mmol.I/1檸檬酸鈉溶液溶解微膠珠，之后離心收獲分化細胞，分析其神經前體細胞標志Nestin的基因表達以及Nestin陽性細胞的百分比，并將其接種到培養板中，貼壁后加入含有10%血清的DMEM/F12培養液，繼續分化I周，通過進行β -tubulin III和GFAP熒光染色來檢測獲得的神經前體細胞向神經元和星型膠質細胞分化的能力。結果顯示，動態三維共培養獲得的分化細胞與使用生長因子誘導的二維以及三維分化細胞相比，其Nestin的基因表達與陽性細胞百分比顯著升高，Nestin陽性細胞百分比約為40%，并且具有向成熟神經細胞分化的能力，這說明此生物反應器系統能夠顯著促進干細胞向神經前體細胞分化并維持了其繼續向成熟神經細胞分化的能力。
[0056]實施例4多種肝基質細胞與MSC共培養，促進MSC向肝細胞的分化
[0057]1)采用灌注結合梯度離心的方法分離大鼠原代肝實質細胞和內皮細胞等非實質細胞(方法參考“昆明醫學院學報，2011，7:22-25 )。
[0058]2)采用成纖維細胞原代培養法獲得大鼠肝組織的成纖維細胞。
[0059]3)參考實施例1中步驟I)獲得大鼠骨髓間充質干細胞。
[0060]4)將步驟I)獲得的原代肝實質細胞按照實施例1步驟3)的方法，以5X 106/ml密度包埋在粒徑為500微米的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0061]5)將步驟I)獲得的原代內皮細胞等非實質細胞，以5X106/ml密度包埋在粒徑為100微米的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0062]6)將步驟2)獲得的成纖維細胞，以2X 105/ml密度包埋在粒徑為700微米的海藻
酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中。
[0063]7)將步驟3)獲得的骨髓間充質干細胞，以5X 107ml密度包埋在粒徑為300微米的海藻酸鈉微膠囊中。
[0064]8)將步驟4)、5)、6)、7)獲得的四種含有不同細胞的微膠囊用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養基，于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱內共培養，四者體積比為1:1:1:1(微囊共培養示意圖見附圖)。
[0065]9)分別在共培養5、14、21天后，分別收集各種微膠囊，并用60目和30目兩種篩網分離三種微膠囊。將在30目篩網漏出但留在60目篩網上的微膠囊收集起來，55mM檸檬酸鈉液化后，分離清洗，即獲得分化后的MSC。結果顯示共培養5天后，長梭形的細胞突起變短、變粗，并有卵圓形細胞出現。共培養14天，細胞呈現多角形、卵圓形或圓形，共培養21天時，細胞白蛋白mRNA的表達量顯著增加，甲胎蛋白mRNA的表達檢測不到。結果均說明MSC分化成肝細胞。
【權利要求】
1.一種用于細胞共培養的生物反應器系統，其特征在于:該生物反應器系統中含有兩種或三種以上規格粒徑的包埋型載體，每種粒徑規格載體包埋一種細胞，不同粒徑規格載體中分別包埋不同種類細胞，將包埋有不同種類細胞的不同規格載體在同一生物反應器中培養，從而在同一體系中實現了兩種或三種以上細胞在三維生長條件下的動態共培養，在培養結束后，借助粒徑篩分系統分別獲得包埋在不同粒徑規格載體中的各種細胞。
2.按照權利要求1所述生物反應器系統，其特征在于:所述生物反應器系統中的包埋型載體粒徑規格在100 μ m到2000 μ m范圍內，各規格之間平均粒徑相差大于等于200 μ m,且每個規格的載體微球粒徑偏差±50 μ m之內。
3.按照權利要求1所述生物反應器系統，其特征在于:所述生物反應器系統中的生物反應器可以是旋轉生物反應器、流化床或固定床型生物反應器、或攪拌式生物反應器。
4.按照權利要求1所述生物反應器系統，其特征在于:所述生物反應器系統中的包埋型載體為海藻酸鈉基的球形載體； 海藻酸鈉基包括海藻酸鈉，以及RGD、IKVAV、YIGSR, PEG、膠原、透明質酸、硫酸軟骨素、魚精蛋白修飾的海藻酸鈉中的一種或二種以上，海藻酸鈉基與二價金屬離子形成的凝膠微球，即為球形載體； 或，上述凝膠微球與聚陽離子靜電絡合形成的微膠囊，即為球形載體。
5.按照權利要求1所述生物反應器系統，其特征在于:所述生物反應器系統用于一種或兩種以上基質細胞與目的細胞之間通過非直接接觸方式由化學信號傳遞進行相互作用的不同細胞組合 ，通過細胞組合間的三維共培養可以相互影響細胞的增殖、凋亡、分化、細胞外泌功能中的一種或二種以上。
6.按照權利要求5所述生物反應器系統，其特征在于:所述基質細胞為對目的細胞定向分化、增殖、組織化或凋亡等多種行為具有調控作用的多來源體細胞、轉基因細胞或細胞株; 其中，多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群; 所述目的細胞為多來源干細胞、體細胞、腫瘤細胞、轉基因細胞或細胞株； 其中，多來源干細胞包括胚胎肝細胞或成體干細胞，多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群。
7.按照權利要求5所述生物反應器系統，其特征在于:所述基質細胞和目的細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、或異源異種細胞。
8.按照權利要求4所述生物反應器系統，其特征在于: 所述二價金屬離子為鈣離子、鋇離子、鋅離子中的一種或兩種以上； 所述聚陽離子為殼聚糖、聚賴氨酸、聚鳥氨酸及它們衍生物中的一種或兩種以上。
9.按照權利要求1所述生物反應器系統，其特征在于:所述生物反應器系統中的粒徑篩分系統可以是不同目數的篩網分離不同粒徑規格的載體，也可以通過流化床體系，實現不同粒徑規格 載體的分離。
【文檔編號】C12M3/00GK103881908SQ201210560038
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】馬小軍, 于煒婷, 劉洋 申請人:中國科學院大連化學物理研究所