一種昆蟲性別調控構建物，調控方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有調控昆蟲性別功能的轉基因構建物。具體地，本發明所述的構建物包括：啟動子、doublesex基因、和終止子，還包括四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件（TAV），并且所述元件插入在doublesex基因的第三個外顯子中。所述的構建物在雌性昆蟲個體中特異表達四環素阻遏反式激活蛋白，導致雌性個體在發育早期死亡而雄性個體不受影響；通過在飼料中添食四環素來控制毒性蛋白的表達，從而建立了一種可調控昆蟲性別的轉基因系統。
【專利說明】一種昆蟲性別調控構建物，調控方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和發育調控領域，具體地，本發明涉及一種昆蟲性別調控構建物，調控方法及其應用。
【背景技術】
[0002]專養雄蠶在蠶業生產上是一項非常重要的技術，因為雄蠶繭的繭層率和鮮繭出絲率要比雌蠶繭高，而且雄蠶食桑量少，葉絲轉化率高；此外，雄蠶體質強健，更容易飼養，而且雄蠶絲纖度細、凈度好，適于剿制高品位生絲。為此，世界各國科學家對專養雄蠶技術進行了一系列的探索。
[0003]1975年俄羅斯科學家Strunnikov V.A.等運用輻射誘變等技術手段，育成了家蠶性連鎖平衡致死系。在性連鎖平衡致死系內自交，其后代雌雄性個體各有一半存活，使品系得以保持。當平衡致死系的雄蟲與常規品系的雌蟲交配的后代只有雄蟲能夠存活，雌蟲全部致死，達到專養雄蠶的目的。1996年，浙江省農業科學院從俄羅斯科學院引進了以家蠶性連鎖平衡致死系S-8、S-14，并開展了利用性連鎖平衡致死技術實現專養雄蠶的研究。經10年攻關研究，創建了家蠶性連鎖平衡致死系細胞控制基因和導入方法(專利號:ZL01132108.3)、回交改良家蠶性連鎖平衡致死系的方法(專利號:ZL01126809.3)、一種雜交改良家蠶性連鎖平衡致死系性狀的方法(專利號:200810061660.5)三項國家發明專利；建立了一個低成本的雄蠶雜交種繁育方法；育成了秋華X平30、華菁X平60等家蠶性連鎖平衡致死實用蠶品種，雄蠶率達99.8%，繭層率和出絲率比常規品種提高23%，綜合經濟效￡fL提聞20%左右。
[0004]利用輻射處理等手段可以使雄蟲不育，然后通過大量飼養不育雄蟲并進行野外釋放，不育雄蟲與自然種群中的雌蟲交配后不能產生后代，從而達到害蟲防治的目的。這種昆蟲不育技術(Sterile Insect Technique, SIT)在防治螺旋蠅、柑橘大實蠅等害蟲方面已經取得了成功。但是該方法也存在著一些問題，如處理后的害蟲競爭力差、大規模飼養成本高
坐寸ο
[0005]由于性連鎖平衡致死體系使用的家蠶品種是通過輻射突變所獲得，品種內的染色體結構和遺傳穩定性存在著變異的可能。因此，本領域目前迫切需要開發新型技術來彌補性連鎖平衡致死系統的不足。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供一種昆蟲性別調控構建物。
[0007]本發明的另一目的就是提供一種昆蟲性別調控方法及其應用。
[0008]在本發明的第一方面，提供了一種轉基因構建物，所述的構建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件 (TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。[0009]在另一優選例中，所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個外顯子中。
[0010]在另一優選例中，所述的構建物還包括四環素結合序列(TetO)。
[0011]在另一優選例中，所述的構建物還包括選自下組的元件或其組合:啟動子、終止子、POly(A)元件、轉運元件、基因靶向元件、篩選標記基因、增強子、抗性基因、轉座酶編碼基因。
[0012]在另一優選例中，所述的doublesex基因來自鱗翅目昆蟲。
[0013]在另一優選例中，所述的鱗翅目昆蟲包括(但不限于):家蠶、亞洲玉米螟、棉鈴蟲、或小菜蛾。
[0014]在另一優選例中，所述的doublesex基因來自家蠶。
[0015]在另一優選例中，所述的doublesex基因(雙性基因)具有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0016]在另一優選例中，所述的四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0017]在另一優選例中，所述的篩選標記基因為熒光蛋白編碼基因，優選gfp(綠色熒光蛋白編碼基因、或DsRed紅色熒光蛋白編碼基因。
[0018]在另一優選例中 ，所述的四環素結合序列(TetO)具有SEQ ID NO:3所示的序列。
[0019]在另一優選例中，所述的doublesex基因與啟動子或終止子可操作地連接。
[0020]在本發明的第二方面，提供了一種載體，所述載體含有第一方面所述的轉基因構建物。
[0021]在另一優選例中，所述載體選自:細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、或動物細胞載體、穿梭載體。
[0022]在另一優選例中，所述的載體為轉座子載體。
[0023]在本發明的第三方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有第一方面所述的構建物或第二方面所述的載體，或所述的宿主細胞染色體整合有第一方面所述的構建物或第二方面所述的載體。
[0024]在另一優選例中，所述的宿主細胞還包括含有編碼轉座酶基因的載體或其染色體上整合有轉座酶基因。
[0025]在另一優選例中，所述的宿主細胞為昆蟲細胞。
[0026]在另一優選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟、棉鈴蟲、小菜蛾等。
[0027]在本發明的第四方面，提供了第一方面所述的構建物，第二方面所述的載體，或第三方面所述的宿主細胞的用途，被用于昆蟲性別調控，或用于制備調控昆蟲性別的組合物。
[0028]在本發明的第五方面，提供了一種制備轉基因昆蟲的方法，包括步驟:
[0029](a)提供昆蟲細胞或昆蟲卵，所述昆蟲細胞或昆蟲卵含有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體、或其染色體整合有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體；
[0030](b)將步驟(a)所述的昆蟲細胞或昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得所述的轉基因昆蟲。[0031 ] 在另一優選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲。
[0032]在另一優選例中，步驟(a)所述的宿主細胞為家蠶初產卵細胞。
[0033]在本發明的第六方面，提供了一種轉基因昆蟲，所述的轉基因昆蟲含有第三方面所述的宿主細胞，或所述的轉基因昆蟲染色體整合有第一方面所述的構建物或第二方面所述的載體，或所述的轉基因昆蟲是由第三方面所述的宿主細胞再生而成的。
[0034]在另一優選例中，所述的轉基因昆蟲是用第五方面所述的方法制備的。
[0035]在本發明的第七方面，提供了第六方面所述轉基因昆蟲的用途，所述的轉基因昆蟲用于:
[0036](1)生產蠶絲；
[0037](2)提高蠶繭繭層率；
[0038](3)提高葉絲轉化率；
[0039](4)提高蠶絲纖度；
[0040](5)提高蠶絲凈度； [0041](6)或其組合。
[0042]在本發明的第八方面，提供了一種調節昆蟲性別的方法，包括步驟:
[0043](a)提供昆蟲細胞或昆蟲卵，所述昆蟲細胞或昆蟲卵含有第一方面所述的構建物或第二方面所述的載體、或其染色體整合有第一方面所述的構建物或第二方面所述的載體，并所述的昆蟲細胞或昆蟲卵再生為昆蟲；
[0044](b)在缺乏四環素的條件下飼喂步驟(a)所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%的昆蟲群。
[0045]在另一優選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，優選家蠶。
[0046]在另一優選例中，所述的調節昆蟲性別為:提高雄性昆蟲在總昆蟲中的比例。
[0047]在另一優選例中，步驟(b)獲得雄性昆蟲存活比例大于96% (優選大于98%)的昆蟲群。
[0048]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0050]圖1:轉基因載體pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA示意圖；DsRed表示作為分子標記的紅色突光蛋白DsRed ；Tet0x7表示四環素結合序列；E1_E5表示doublesex基因的5個外顯子結構；TAV表示四環素阻遏反式激活蛋白編碼序列，其位于doublesex基因的第3個外顯子內部。
[0051]圖2:轉基因家蠶陽性個體；圖2A:正常視野下的蠶卵；圖2B紅色熒光視野下的蠶卵。
[0052]圖3:死亡的雌性個體和正常發育的雄性個體；左側為死亡的個體，顏色較深；右側為正常發育的個體，顏色較淺。【具體實施方式】
[0053]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次提供了一種具有調控昆蟲性別功能的轉基因構建物。具體地，所述的構建物包括:啟動子、doublesex基因、和終止子，還包括四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述元件插入在doublesex基因的第三個外顯子中。所述的構建物在雌性昆蟲個體中特異表達四環素阻遏反式激活蛋白，導致雌性個體在發育早期死亡而雄性個體不受影響；通過在飼料中添食四環素來控制毒性蛋白的表達，從而建立了一種可調控昆蟲性別的轉基因系統。在此基礎上完成了本發明。
[0054]術語
[0055]如本文所用，術語“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種準確有效起始基因轉錄功能的核酸序列，引導基因核酸序列轉錄為mRNA，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，一般地，啟動子或啟動子區域提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。
[0056]在本文中，所述啟動子或啟動子區(域)包括啟動子的變體，啟動子變體可以通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0057]如本文所用，“外源的”或“異源的”是指不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。
[0058]如本文所用，“順式調控元件”是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守性堿基序列。
[0059]本發明的啟動子可以被可操作地與外源基因連接，該外源基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。
[0060]本發明所述的外源基因(也稱為目的基因)優選doublesex基因，與啟動子或終止子可操作地連接。所述的doublesex基因優選來自于鱗翅目昆蟲(如家蠶)，并具有SEQID NO:1所示的序列。
[0061]如本文所用，術語“鱗翅目昆蟲”沒有特別的限制，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟，棉鈴蟲，小菜蛾。
[0062]doublesex基因(雙性基因)
[0063]如本文所用，術語“doublesex基因”與“雙性基因”可以互換使用。doublesex基因是昆蟲性別決定機制中的最下游基因，在性別發育中起到重要作用。
[0064]編碼家蠶doublesex基因開放閱讀框的序列由5個外顯子組成,其中第3和第4外顯子在雌性中表達，而在雄性中不表達，從而在不同性別中由于性別特異性的選擇性剪接作用最終導致編碼不同的蛋白(見Suzuki etal, Dev Genes Evol.2003)。
[0065]在本發明的一個優選例中，doublesex基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示。應理解，所述的doublesex基因還包括SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列的活性片段，變體，或類似物。
[0066]所述的活性片段，變體， 或類似物可以是SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列具有50%或以上(優選60%以上，70%以上，80%以上，更優選90%以上，更優選95%以上，最優選98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的核苷酸。核苷酸變體可以經過若干個(通常為1-60個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)取代、缺失或添加至少一個核苷酸所得的衍生序列，以及在5’末端和/或3’末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)核苷酸。核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變所述核苷酸的功能。
[0067]根據本文所述的核苷酸序列，本【技術領域】人員可方便地用各種已知方法制得本發明的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發明的一種實施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進行重疊延伸PCR的方法來構建所述的核酸序列。
[0068]選擇性剪切外顯子
[0069]選擇性剪切外顯子是指doublesex基因的第三、四外顯子(SEQ ID N0:1的647位-904位)。doublesex基因的外顯子在不同性別昆蟲中有不同的剪切方式，在雄性昆蟲中，doublesex基因的第三、四外顯子會被剪切掉，而雌性昆蟲會保留。四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)如果插入到doublesex基因第三或第四外顯子中，在雄性昆蟲中，TAV會與doublesex基因第三或第四外顯子被選擇性剪切掉，TAV不表達，在雌性昆蟲中，doublesex基因第三或第四外顯子不被剪切，TAV表達。
[0070]四環素結合序列(TetO)與四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)的調控作用，本領域的普通技術人員均可以從常規途徑獲得所述技術方法和知識，如(Hinrichs etal, Science, 1994)。
[0071]轉基因構建物 [0072]本發明提供了一種轉基因構建物，所述的構建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。
[0073]優選地，所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個外顯子中。
[0074]所述的構建物還可以包括四環素結合序列(TetO);所述的四環素結合序列(TetO)具有SEQ ID NO: 3所示的序列。
[0075]在另一優選例中，所述的構建物還包括選自下組的元件或其組合:啟動子、終止子、poly(A)元件、轉運元件、基因靶向元件、篩選標記基因、增強子、抗性基因、轉座酶編碼基因。
[0076]所述的篩選標記基因優選熒光蛋白編碼基因，更優選gfp(綠色熒光蛋白編碼基因或DsRed紅色熒光蛋白編碼基因。
[0077]在另一優選例中，所述的四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0078]載體，宿主細胞
[0079]本發明還提供了一種載體，所述載體含有本發明的轉基因構建物。優選地，所述載體選自:細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、或動物細胞載體、穿梭載體；所述的載體為轉座子載體。用于制備重組載體的方法是本領域普通技術人員所熟知的。只要其能夠在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都是可以被米用的。[0080]本領域普通技術人員可以使用熟知的方法構建含有本發明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術
坐寸ο
[0081]本發明還提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有所述的構建物或載體，或所述的宿主細胞染色體整合有所述的構建物或載體。在另一優選例中，所述的宿主細胞還包括含有編碼轉座酶基因的載體或其染色體上整合有轉座酶基因。
[0082]優選地，所述的宿主細胞為昆蟲細胞。在另一優選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟，棉鈴蟲，小菜蛾等。
[0083]本發明的構建物或載體，可以用于轉化適當的宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌:或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等動物細胞，如昆蟲細胞。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物(如大腸桿菌)時，可以用CaCl2法處理，也可用電穿孔法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法(如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等)。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。
[0084]應用
[0085]本發明還提供了一種制備轉基因昆蟲的方法，包括步驟:提供本發明所述的轉化宿主細胞(優選家蠶初產卵細胞)；將所述的宿主細胞再生為昆蟲，從而獲得所述的轉基因昆蟲。所述的昆蟲優選為鱗翅目昆蟲。
[0086]本發明還提供了一 種用上述方法制備的一種轉基因昆蟲。并且所述的轉基因昆蟲可以用于:生廣香絲；提聞香苗苗層率；提聞葉絲轉化率；提聞香絲纖度；提聞香絲凈度；或其組合。
[0087]本發明還提供了一種調節昆蟲性別的方法，包括步驟:獲得本發明所述的轉基因昆蟲；在缺乏四環素的條件下飼喂所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%，優選大于96%，更優選大于98%的昆蟲群。在另一優選例中，所述的調節昆蟲性別為:提高雄性昆蟲在總昆蟲中的比例。
[0088]在本方面的一個具體實施例中，將本發明的轉基因載體與可表達轉座酶的輔助質粒混合后通過顯微注射導入原胚期蠶卵，25°C條件下保護至孵化。孵化后的蟻蠶飼養至成蟲后，自交或回交獲得Gl代蠶卵，在Gl代胚胎發育后期(6-8天)在熒光顯微鏡下篩選出全身表達紅色熒光的轉基因個體。
[0089]Gl代轉基因個體飼養至成蟲后與正常個體回交得到G2代轉基因雜合個體。G2代轉基因雜合個體采用兩種方式飼養:1.在飼料中添加四環素，雌性和雄性都可以正常發育。2.飼料中不添加四環素，雌性個體在幼蟲早期死亡，而雄性個體發育不受影響。
[0090]本發明的主要優點在于:
[0091](I)本發明通過建立轉基因昆蟲品系，在雌性個體中特異表達四環素阻遏反式激活蛋白，導致雌性個體在發育早期死亡而雄性個體不受影響；
[0092](2)通過在飼料中添食四環素來控制毒性蛋白的表達，是一種可調控的轉基因系統，便于建立純和保持品系；
[0093](3)本發明首次利用轉 基因手段開發出雌性致死的轉基因家蠶品系，雌性致死的作用機制清晰；
[0094](4)本發明突破了以往通過傳統育種方法選育費時費力，且作用機制不明了的瓶頸；
[0095](5)本發明不僅可在蠶業生產中發揮重要的作用，也可推廣到害蟲特別是鱗翅目害蟲的遺傳防治，為害蟲防治提供新的途徑。
[0096]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0097]實施例1
[0098]家蠶雌性特異致死轉基因系統的構建
[0099]1.PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA 轉基因載體的構建
[0100]本實施例采用的PBaC-1ElDSRed2-tet0-tTA轉基因載體是基于廣泛應用于昆蟲轉基因研究的 Piggybac 轉座子(Piggybac 轉座子見 Fraser et al., Insect MolecularBiology, 1996)加以改造完成的。
[0101]首先在Piggybac轉座子載體中導入了由IEl啟動子(Kojima etal, VirusResearch, 2008)驅動的色突光蛋白DsRed (DsRed基因序列如SEQ ID NO:4所示)，構建成為pBac-1ElDSRed2轉基因載體。成功轉入此載體后，轉基因陽性個體從胚胎后期可以全身表達紅色熒光，便于篩選。
[0102]克隆來自家蠶的doublesex基因(doublesex基因序列如SEQ ID N0:1所示)，并將編碼四環素阻遏反式激活蛋白TAV的DNA序列(TAV的DNA序列如SEQ IDNO:2所示)插入doublesex基因的第三個外顯子內(第三個外顯子的序列如SEQID NO:5所示)，插入位點為第三個外顯子的第44位-第45位之間，構成了一個融合基因(融合基因序列為SEQ IDNO:6)。
[0103]由于性別特異的基因選擇性剪接作用(雄性中表達doublesex基因不需要第三外顯子的介入)，轉基因雌性個體將完整表達TAV，而雄性個體則不表達。
[0104]在TAV和doublesex融合基因的上游導入了四環素結合序列TetO (TetO的序列如SEQ ID NO:3所示)，最終構建了目的轉基因載體PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA (圖1)。
[0105]實施例2
[0106]轉基因系統的建立
[0107]將實施例1制備的轉基因載體pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA與可表達Piggybac轉座酶的質粒 PHA3PIG (該質粒見 Tamura et al., Nature Biotechnology, 2000)等量混合后注射到家蠶初產卵(產下后4-8小時)中。
[0108]注射質粒的純化采用Qiagen公司的Plasmid Midi kit試劑盒,蠶卵的注射方法參照Kanda & Tamura (1991)描述的方法進行顯微注射,注射后的蠶卵用無毒速干膠封口。注射后的蠶卵放在保濕盒子中，在25°C條件下進行催青直到孵化。
[0109]孵化后收集蟻蠶用桑葉飼養至上 簇結繭，蛹期25°C條件下保護至化蛾后，將當代(GO)的蠶蛾自交后，獲得Gl代蠶卵。在Gl代蠶卵的胚胎發育后期利用熒光顯微鏡下挑出具有紅色熒光的轉基因個體進行飼養(圖2)。[0110]發明人共注射了 768粒家蠶卵(G0代)，孵化了 492頭，最終發育到成蟲正常交配后得到的卵圈有95個(Gl代)。在這些卵的發育后期檢測到12個卵圈具有陽性個體(紅色熒光)。通過進一步的確認，挑選其中三個品系實施了下一步的試驗，在這三個獨立品系中得到的結果具有非常高的重復性。
[0111]實施例3
[0112]雌性特異性致死效果的鑒定
[0113]鑒定方法:
[0114]雌性特異性致死效果可以通過如下步驟進行鑒定:在桑葉上噴灑濃度為200 μ g/μ I四環素水溶液，喂食轉基因家蠶，在此條件下轉基因家蠶無論雌雄都可以正常發育；而如果在桑葉上不添加四環素喂食轉基因家蠶，則有一半左右的家蠶會再幼齡期死亡(圖3)。而死亡的幼蟲經PCR檢測，未擴增出雄性特異條帶，可判斷為雌性。
[0115]而作為對照，非轉基因家蠶在喂食了添加200μ g/μ I四環素水溶液或無添加四環素水溶液后對發育無不良影響。
[0116]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考 那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種轉基因構建物，其特征在于，所述的構建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。
2.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述四環素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個外顯子中。
3.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的構建物還包括四環素結合序列(TetO)。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1-3任一所述的轉基因構建物。
5.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體，或所述的宿主細胞染色體整合有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體。
6.權利要求1所述的構建物，權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的宿主細胞的用途，其特征在于，被用于昆蟲性別調控，或用于制備調控昆蟲性別的組合物。
7.一種制備轉基因昆蟲的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供昆蟲細胞或昆蟲卵，所述昆蟲細胞或昆蟲卵含有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體、或其染色體整合有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體； (b)將步驟(a)所述的昆蟲細胞或昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得所述的轉基因昆蟲。
8.—種轉基因昆蟲，其特征在于，所述的轉基因昆蟲含有權利要求5所述的宿主細胞，或所述的轉基因昆蟲染色體整合有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體，或所述的轉基因昆蟲是由權利 要求5所述的宿主細胞再生而成的。
9.權利要求8所述轉基因昆蟲的用途，其特征在于，所述的轉基因昆蟲用于: (1)生產蠶絲； (2)提聞香苗苗層率； (3)提高葉絲轉化率； (4)提高蠶絲纖度； (5)提高蠶絲凈度； (6)或其組合。
10.一種調節昆蟲性別的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供昆蟲細胞或昆蟲卵，所述昆蟲細胞或昆蟲卵含有權利要求1-3任一所述的構建物或權利要求4所述的載體、或其染色體整合有權利要求1所述的構建物或權利要求4所述的載體，并所述的昆蟲細胞或昆蟲卵再生為昆蟲； (b)在缺乏四環素的條件下飼喂步驟(a)所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%的昆蟲群。
【文檔編號】C12N5/10GK103882013SQ201210559254
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】黃勇平, 譚安江, 孟智啟, 牛寶龍, 尤朗 申請人:中國科學院上海生命科學研究院