豬附紅細胞體的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬附紅細胞體的檢測方法，依次包括病原的分離純化，豬附紅細胞體DNA的提取，引物的設計與合成，PCR的檢測，擴增產(chǎn)物的回收、鑒定及測序的步驟。相對于IHA、ELISA等其他檢測方法而言，其特異性高、敏感性強，準確性可靠性大；能快速、簡便、可靠、準確的檢測出樣品中的附紅細胞體，也可用于附紅細胞體病的流行病學調(diào)查和療效檢測。
【專利說明】豬附紅細胞體的檢測方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬附紅細胞體的檢測方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]目前對附紅細胞體病的診斷仍多采用鏡檢的方法，但由于一些人為的因素及該病多呈混合感染，常會發(fā)生誤診。臨床上該病的診斷方法主要以直接鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和涂片染色，但是假陽性率高，動物實驗方法是確診的手段，但所費時間太長，費用高，血清學方法包括間接血凝試驗、補體結(jié)合試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗等，由于附紅細胞體的抗體變化起伏較大，這些方法也不適用于該病的診斷。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種豬附紅細胞體的檢測方法，能快速、簡便、可靠、準確的檢測出附紅細胞體病，以滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)學診斷的需求。
[0007]本發(fā)明提供的豬附紅細胞體的檢測方法，包括以下步驟:
一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫?br> 二、豬附紅細胞體DNA的提取,按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存?zhèn)溆茫?br> 三、引物的設計與合成，根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
四、PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條件進行優(yōu)化，最終確定反應體系為:10XPCR 緩沖液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，取PCR產(chǎn)物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳；
五、取PCR產(chǎn)物5uL，進行瓊脂糖核酸電泳后，按膠回收試劑盒說明進行回收，回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。在氨芐平板上篩選出可疑性克隆，陽性質(zhì)粒送去Takara測序。
[0008]本發(fā)明提供的豬附紅細胞體的檢測方法，其有益效果在于，提供了一種檢測附紅細胞體病的標準方法，該方法采用的是PCR，相對于IHA、ELISA等其他檢測方法而言，其特異性高、敏感性強，準確性可靠性大；能快速、簡便、可靠、準確的檢測出樣品中的附紅細胞體，也可用于附紅細胞體病的流行病學調(diào)查和療效檢測；16Sr RNA的相對分子量大小適中，約1540個核苷酸，便于序列分析；可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設計引物，將16SrDNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定。
[0009]
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合一個實施例，對本發(fā)明提供的豬附紅細胞體的檢測方法進行詳細的說明。
[0011]
實施例
[0012]本實施例的豬附紅細胞體的檢測方法，包括以下步驟:
一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫? 二、豬附紅細胞體DNA的提取,按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存?zhèn)溆茫?br> 三、引物的設計與合成，根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
四、PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條件進行優(yōu)化，最終確定反應體系為:10XPCR 緩沖液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，取PCR產(chǎn)物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳；
五、取PCR產(chǎn)物5uL，進行瓊脂糖核酸電泳后，按膠回收試劑盒說明進行回收，回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。在氨芐平板上篩選出可疑性克隆，陽性質(zhì)粒送去Takara測序。
【權(quán)利要求】
1.一種豬附紅細胞體的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫? 二、豬附紅細胞體DNA的提取,按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存?zhèn)溆茫? 三、引物的設計與合成，根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '； 四、PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條件進行優(yōu)化，最終確定反應體系為:IOXPCR 緩沖液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，取PCR產(chǎn)物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳； 五、取PCR產(chǎn)物5uL，進行瓊脂糖核酸電泳后，按膠回收試劑盒說明進行回收，回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，在氨芐平板上篩選出可疑性克隆，陽性質(zhì)粒送去Takara測`序。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882098SQ201210561085
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權(quán)汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司