雜交瘤細胞的培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種雜交瘤細胞的培養方法，包括如下步驟：將雜交瘤細胞懸液接種到含有大孔微載體和培養基的攪拌瓶中并于攪拌條件下培養，得到生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞；將生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞在攪拌瓶中逐級放大培養，同時逐漸降低培養基中血清的含量直至為零，得到適應無血清培養基的雜交瘤細胞；采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，得到密度大于1×107細胞/mL的適應無血清培養基的雜交瘤細胞，即具有高細胞密度的雜交瘤細胞。
【專利說明】雜交瘤細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養【技術領域】，特別是涉及一種雜交瘤細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002]動物細胞能夠生產許多重要的生物制品，而大規模動物細胞培養是生產重組蛋白治療藥物的有效途徑，因此，大規模動物細胞培養技術已成為生物制藥領域最重要的關鍵技術之一。
[0003]傳統工業化生產動物細胞表達重組蛋白治療藥物的主要方法是通過利用各種動物細胞培養反應器，在體外大規模高密度培養雜交瘤細胞、昆蟲細胞、微生物等,再通過相關的純化手段濃縮純化制備重組蛋白產品。其中，高密度培養動物細胞是高效獲得大量重組蛋白治療藥物的關鍵。
[0004]傳統的微載體雜交瘤細胞培養反應器多集中在機械攪拌式反應器的研究，該類反應器存在機械剪切力力，結構復雜，不易密封，放大培養困難；而且氣泡與細胞直接接觸也不利于細胞的貼壁生長。培養過程中雜交瘤細胞的細胞密度也不夠理想，限制了雜交瘤細胞在大規模工業化生產重組蛋白治療藥物中的應用。

【發明內容】

[0005]基于此，有必要提供一種具有高細胞密度的雜交瘤細胞的培養方法。
[0006]一種雜交瘤細胞的培養方法，包括如下步驟:
[0007]將雜交瘤細胞懸液接種到含有大孔微載體和培養基的攪拌瓶中攪拌培養，得到生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞，其中，培養條件為:培養基的PH為7.0-7.2，培養基中血清的質量分數為5%，培養溫度37°C，溶氧的質量分數為30%，CO2的質量分數為5%，培養基中大孔微載體的濃度為1.2^1.5g/L，攪拌速率為20-40轉/分鐘；
[0008]將生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞在攪拌瓶中逐級放大培養，同時逐漸降低培養基中血清的含量直至為零，然后加入胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6，繼續培養，得到適應無血清培養基的雜交瘤細胞；
[0009]當上述適應無血清培養基的雜交瘤細胞的密度達到I X IO6~1.2 X IO6細胞/mL時，將所述適應無血清培養基的雜交瘤細胞接種到通氣攪拌生物反應器中，采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，得到密度大于I X IO7細胞/mL的雜交瘤細胞，其中，通氣攪拌生物反應器中預先加入了大孔微載體、培養基、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6，培養條件為:培養基的PH為7.0-7.2，攪拌速率為70-90轉/分鐘，灌流速率為1.5升/天，溶氧的質量分數為30%，培養基中大孔微載體的濃度為1.5^3.0g/mL。
[0010]在其中一個實施例中，還包括在使用大孔微載體之前對所述大孔微載體進行預處理的步驟，具體如下:[0011]將大孔微載體置于磷酸鹽緩沖液中浸泡使其膨脹；用磷酸鹽緩沖液洗滌膨脹后的大孔微載體，并高壓滅菌，然后在無菌環境下除去磷酸鹽緩沖液，然后用培養基洗滌后置于4°c備用。
[0012]在其中一個實施例中，還包括在得到密度大于IXlO7細胞/mL的雜交瘤細胞后，采用連續灌流的培養方式于無血清表達型培養基中培養密度大于IX IO7細胞/mL的雜交瘤細胞的步驟。
[0013]在其中一個實施例中，還包括在無血清生長型培養基中培養雜交瘤細胞過程中采用細胞截留裝置除去通氣攪拌生物反應器中死細胞、細胞碎片以及自溶物的步驟。
[0014]在其中一個實施例中，所述雜交瘤細胞為用于生產抗人A型血細胞表面抗原的單克隆抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞。
[0015]在其中一個實施例中，所述大孔微載體為纖維素大孔微載體、明膠大孔微載體或膠原大孔微載體。
[0016]在其中一個實施例中，細胞的密度是由高效液相色譜法、酶法測定葡萄糖消耗速率或酶法測定乳酸生成速率確定。
[0017]在其中一個實施例中，所述微量元素為鐵、鎂、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、氟、硼及砷；所述氨基酸為蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸。
[0018]由于雜交瘤細胞屬于半貼壁細胞，為了增加其培養密度，一般需將其固定化。而細胞的懸浮培養方法相對于細胞的貼壁培養方法具有很多優點，如，傳代時無需胰酶消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細胞收率高，并可在線連續直接檢測細胞密度。
[0019]而上述雜交瘤細胞的培養方法，首先，采用大孔微載體細胞固定化技術將雜交瘤細胞固定在大孔微載體上，再通過逐級放大培養技術增加雜交瘤細胞的培養密度，然后將達到一定細胞密度的雜交瘤細胞轉入通氣攪拌生物反應器中，并采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，從而獲得具有更高細胞密度的雜交瘤細胞。同時在細胞培養基中加入人重組白細胞介素IL-6，進一步提高雜交瘤細胞的細胞密度，雜交瘤細胞的細胞密度通常可以達到大于IXlO7細胞/mL。而且具體試驗的檢測數據表明，雜交瘤細胞的細胞密度可以達到1.5 X IO7細胞/mL，活細胞比例可維持在90%左右，培養上清液中蛋白產品的滴度一般可達1:150000，整個培養時間可維持在2個月以上。因此上述培養方法能培養出具有高細胞密度的雜交瘤細胞，從而獲得高產量的蛋白產品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為一實施方式的雜交瘤細胞的培養方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖及具體實施例對雜交瘤細胞的培養方法進行進一步的說明。
[0022]如圖1所示，一實施方式的雜交瘤細胞的培養方法，包括如下步驟:
[0023]步驟110，將雜交瘤細胞懸液接種到含有大孔微載體和培養基的攪拌瓶中并于攪拌條件下培養，得到生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞，其中，培養條件為:培養基的PH為
7.0-7.2，培養基中血清的質量分數為5%，培養溫度37°C，溶氧的質量分數為30%，CO2的質量分數為5%，培養基中大孔微載體的濃度為1.2^1.5g/L，攪拌速率為20-40轉/分鐘。
[0024]步驟120，將生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞在攪拌瓶中逐級放大培養，同時逐漸降低培養基中血清的含量直至為零，然后加入胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6 (rhIL-6)，繼續培養，得到適應無血清培養基的雜交瘤細胞。
[0025]步驟130，將密度為I X 10^1.2 X IO6細胞/mL的適應無血清培養基的雜交瘤細胞接種到通氣攪拌生物反應器中，并采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，得到密度大于I X IO7細胞/mL的適應無血清培養基的雜交瘤細胞，其中，通氣攪拌生物反應器中預先加入了大孔微載體、培養基、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6，培養條件為:培養基的pH為
7.0-7.2，攪拌速率為70-90轉/分鐘，灌流速率為1.5升/天，溶氧的質量分數為30%，培養基中大孔微載體的濃度為1.5^3.0g/mL。
[0026]在本實施方式中，雜交瘤細胞為生產抗人A型血細胞表面抗原的單克隆抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞。當然，也可以是其他種類的雜交瘤細胞。
[0027]在本實施方式中，還包括對所述大孔微載體進行預處理的步驟，具體如下:
[0028]將大孔微載體置于磷酸鹽緩沖液中浸泡使其膨脹；用磷酸鹽緩沖液洗滌膨脹后的大孔微載體，并高壓滅菌，然后在無菌環境下除去磷酸鹽緩沖液，然后用培養基洗滌后置于4°C備用。
[0029]在本實施方式中，大孔微載體為纖維素大孔微載體。大孔微載體可用于填充床、流化床、攪拌等生化反應器，且在灌流反應器中可保持數月的良好生產力，能在降低培養基血清含量的同時保證細胞和目的產物的產量。當然也可以是其他種類的大孔微載體，如明膠大孔微載體、膠原大孔微載體等。
[0030]在雜交瘤細胞的培養過程中，雜交瘤細胞的細胞密度是一個非常重要的數據，雜交瘤細胞的細胞密度可以用來確定細胞處于的生長期、指導培養者適時更換培養液等。在本實施方式中，采用酶法測定葡萄糖消耗速率，根據葡萄糖消耗速率分析確定雜交瘤細胞的細胞密度。當然，也可以采用高效液相色譜法測定葡萄糖消耗速率；還可以采用高效液相色譜法或酶法測定乳酸生成速率來分析確定雜交瘤細胞的細胞密度。
[0031]在細胞培養過程中，及時除去培養過程中產生的死細胞、細胞碎片、自溶物等，對細胞的正常生長非常重要。在本實施方式中，還包括采用細胞截留裝置除去通氣攪拌生物反應器中死細胞、細胞碎片以及自溶物的步驟。
[0032]在上述雜交瘤細胞的培養方法，無血清培養環節對于獲得高細胞密度的雜交瘤細胞非常重要，但是血清中含有豐富的細胞生長必須的營養成份。因此，在本實施方式，無血清培養環節中需要補充細胞生長必須的營養成份，如胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、12種微量元素、8種必須氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6等。12種微量元素分別為鐵、鎂、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、氟、硼及砷。8種必須氨基酸分別為蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸。
[0033]其中，各種物質在培養基中的濃度優選為5mg/L的胰島素，5mg/L的轉鐵蛋白，2^5mg/L的乙醇胺，1~2.5mg/L的β巰基乙醇，2 μ g/L的氫化可的松、400U/mL的rhIL_6。
[0034]而培養雜交瘤細胞的最終目的是為了獲得高產量的蛋白產品，因此，在本實施方式中，還包括采用連續灌流的培養方式與無血清表達型培養液培養密度大于IX IO7細胞/mL的適應無血清培養液的雜交瘤細胞的步驟。其中，無血清生長型培養基的配方為:RPM1-1640/F12 以 1:1 混合成 IL ;并加入 1.2g NaHC03，5mg 胰島素，5mg 轉鐵蛋白，2_5mg乙醇胺，l-2.5mgi3巰基乙醇，2yg氫化可的松、12種微量元素，八種必須氨基酸，以及400U/mL 的 rhIL-6 ;用 15mMHEPES 調 pH 至 7.2-7.4 (其中 RPM1-1640, F12 均為商業化的基礎培養基)。無血清表達型培養基的配方為:RPM1-1640/F12以1:1混合成IL ;并加入
1.2gNaHC03, 5mg胰島素,5mg轉鐵蛋白，2_5mg乙醇胺，1-2.5mgP巰基乙醇，12種微量元素、八種必須氨基酸；用15mM HEPES調pH至7.2-7.4 (其中RPM1-1640、F12均為商業化的基礎培養基)。上述培養基制備過程需要過濾除菌。
[0035]由于雜交瘤細胞屬于半貼壁細胞，為了增加其培養密度，一般需將其固定化。而細胞的懸浮培養方法相對于細胞的貼壁培養方法具有很多優點，如，傳代時無需胰酶消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細胞收率高，并可在線連續直接檢測細胞密度。
[0036]而上述雜交瘤細胞的培養方法，首先，采用大孔微載體細胞固定化技術將雜交瘤細胞固定在大孔微載體上，再通過逐級放大培養技術增加雜交瘤細胞的培養密度，然后將達到一定細胞密度的雜交瘤細胞轉入通氣攪拌生物反應器中，并采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，從而獲得具有更高細胞密度的雜交瘤細胞。同時在細胞培養基中加入人重組白細胞介素IL-6，進一步提高雜交瘤細胞的細胞密度，雜交瘤細胞的細胞密度通常可以達到大于I X IO7細胞/mL。而且具體試驗的檢測數據表明，雜交瘤細胞的細胞密度可以達到1.5 X IO7細胞/mL，活細胞比例可維持在90%左右，培養上清液中蛋白產品的滴度一般可達1:150000，整個培養時間可維持在2個月以上。因此上述培養方法能培養出具有高細胞密度的雜交瘤細胞，從而獲得高產量的蛋白產品。
[0037]以下為具體實施例部分
[0038]將大孔微載體置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡3小時使其膨脹，除去PBS，然后用PBS洗滌膨脹后的大孔微載體3次，于121°C下高壓滅菌30分鐘，并于無菌環境下除去PBS ；然后用RPMI1640培養基洗滌2次后置于4°C備用。
[0039]提供培養于培養皿中的分泌抗人A型血細胞表面抗原的單克隆抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞，用培養基吹打多次得到鼠-鼠雜交瘤細胞的單細胞懸液；將鼠-鼠雜交瘤細胞的單細胞懸液接種到含有大孔微載體與RPMI1640培養基的攪拌瓶中并于攪拌條件下培養，其中，接種密度為5 X IO5細胞/mL，攪拌瓶中大孔微載體的濃度為1.5g/L，培養基中血清的質量分數為5%，培養溫度37 °C，溶氧的質量分數為30%，CO2的質量分數為5%，攪拌速率為30轉/分鐘，讓細胞較充分的與大孔微載體接觸。培養5小時后，將攪拌速率提升至為50轉/分鐘，繼續培養12小時，得到生長于大孔微載體上的鼠-鼠雜交瘤細胞。
[0040]將上述得到的生長于大孔微載體上的鼠-鼠雜交瘤細胞在攪拌瓶中逐級放大培養，培養條件為溫度37°C，pH為7.0-7.2，轉速為60轉/分鐘。培養3天后，用酶法測定培養基中葡萄糖的濃度，用新培養基置換攪拌瓶中一半的培養基，同時將培養基中的血清含量逐漸降到0，以馴化鼠-鼠雜交瘤細胞適應無血清培養基。然后加入5mg/L的胰島素，5mg/L的轉鐵蛋白，4mg/L乙醇胺，2mg/L β巰基乙醇，2 μ g/L氫化可的松、12種微量元素以及八種必須氨基酸，并加入400U/mL的rhIL-6 (所有的濃度都是于培養基中的終濃度)，繼續培養，得到適應無血清培養基的鼠-鼠雜交瘤細胞。[0041]將得到的適應無血清培養基的鼠-鼠雜交瘤細胞懸液直接接種到5L Celligen通氣攪拌式反應器中培養，接種密度為I X IO6細胞/mL，采用連續灌流培養方式培養，先用無血清生長型培養基培養。培養條件為:pH為7.0±0.05、溶氧的質量分數為30%、溫度為37.(TC ±0.1°C、攪拌轉速為80轉/分鐘、大孔微載體的濃度為2.5g/L培養基；通氣攪拌式反應器中預先加入了 5mg/L的胰島素，5mg/L的轉鐵蛋白，4mg/L的乙醇胺，2mg/L的β巰基乙醇，2 μ g/L的氫化可的松、12種微量元素以及八種必須氨基酸,并加入400U/mL的rhIL_6(所有的濃度都是于培養基中的終濃度)。當細胞密度大于I X IO7細胞/mL后，改無血清表達型培養基培養，每天通過細胞截留系統換液廣1.2個工作體積，將微載體截留在反應器中，收獲含產品的上清液并加入等量新鮮培養基。
[0042]檢測結果:上述Celligen通氣攪拌式反應器中的細胞密度最高可達1.5X107細胞/mL ;活細胞比例維持在90%左右；培養上清液中抗體滴度可達1: 150000 ;整個培養時間可維持在2個月以上。
[0043]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發 明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，包括如下步驟: 將雜交瘤細胞懸液接種到含有大孔微載體和培養基的攪拌瓶中攪拌培養，得到生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞，其中，培養條件為:培養基的PH為7.0-7.2，培養基中血清的質量分數為5%，培養溫度37 °C，溶氧的質量分數為30%，CO2的質量分數為5%，培養基中大孔微載體的濃度為1.2^1.5g/L，攪拌速率為20-40轉/分鐘； 將生長于大孔微載體上的雜交瘤細胞在攪拌瓶中逐級放大培養，同時逐漸降低培養基中血清的含量直至為零，然后加入胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6，繼續培養，得到適應無血清培養基的雜交瘤細胞； 當上述適應無血清培養基的雜交瘤細胞的密度達到1 X IO6^l.2 X IO6細胞/mL時，將所述適應無血清培養基的雜交瘤細胞接種到通氣攪拌生物反應器中，采用連續灌流的培養方式培養，培養基為無血清生長型培養基，得到密度大于1 X IO7細胞/mL的雜交瘤細胞，其中，通氣攪拌生物反應器中預先加入了大孔微載體、培養基、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β巰基乙醇、氫化可的松、微量元素、氨基酸以及人重組白細胞介素IL-6，培養條件為:培養基的PH為7.0-7.2，攪拌速率為70-90轉/分鐘，灌流速率為1.5升/天，溶氧的質量分數為30%，培養基中大孔微載體的濃度為1.5^3.0g/mL。
2.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，還包括在使用大孔微載體之前對所述大孔微載體進行預處理的步驟，具體如下: 將大孔微載體置于磷酸鹽緩沖液中浸泡使其膨脹；用磷酸鹽緩沖液洗滌膨脹后的大孔微載體，并高壓滅菌，然后在無菌環境下除去磷酸鹽緩沖液，然后用培養基洗滌后置于4°C備用。
3.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，還包括在得到密度大于IX IO7細胞/mL的雜交瘤細胞后，采用連續灌流的培養方式于無血清表達型培養基中培養密度大于1 X IO7細胞/mL的雜交瘤細胞的步驟。
4.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，還包括在無血清生長型培養基中培養雜交瘤細胞過程中采用細胞截留裝置除去通氣攪拌生物反應器中死細胞、細胞碎片以及自溶物的步驟。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，所述雜交瘤細胞為用于生產抗人A型血細胞表面抗原的單克隆抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞。
6.根據權利要求1-4中任意一項所述的雜交瘤細胞的培養方法,其特征在于,所述大孔微載體為纖維素大孔微載體、明膠大孔微載體或膠原大孔微載體。
7.根據權利要求1-4中任意一項所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，細胞的密度是由高效液相色譜法、酶法測定葡萄糖消耗速率或酶法測定乳酸生成速率確定。
8.根據權利要求1-4中任意一項所述的雜交瘤細胞的培養方法，其特征在于，所述微量元素為鐵、鎂、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、氟、硼及砷；所述氨基酸為蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸。
【文檔編號】C12N5/20GK103898041SQ201210572731
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】萬曉春, 黨利君, 金言 申請人:深圳先進技術研究院