一種乙醇的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，采用YEPD培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h，接種擴大培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵液中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%，該方法克服了菌體生長慢，發(fā)酵時間長，轉(zhuǎn)化率低的缺陷，有利于實現(xiàn)大規(guī)模的纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)。
【專利說明】—種乙醇的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵含糖物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法，特別涉及一種共發(fā)酵含有五碳糖和六碳糖物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法，本發(fā)明還涉及發(fā)酵含有木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化石能源的日益枯竭，溫室效應(yīng)的逐步顯現(xiàn)，清潔能源已成為全球的研究熱點，以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇受到了廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)物中除葡萄糖外，還含有大量以木糖為主的五碳糖，因此發(fā)酵戊糖(半纖維素混合糖)生產(chǎn)乙醇是提高乙醇總收率、降低生產(chǎn)成本的重要措施之一。例如玉米秸桿，以葡萄糖含量約占40%，木糖含量約為20%來計算，木糖轉(zhuǎn)化乙醇的產(chǎn)量可占到總乙醇產(chǎn)量的1/3。
[0003]自然界中高效產(chǎn)醇的微生物通常只能利用葡萄糖等六碳糖生產(chǎn)乙醇，不能利用木糖；而少數(shù)能利用木糖產(chǎn)醇的微生物，產(chǎn)醇能力低下，這限制了對自然界中木質(zhì)纖維素的有效利用。近20多年來，研究人員對木糖在釀酒酵母的運輸、木糖至木酮糖代謝途徑的選擇、木酮糖轉(zhuǎn)化速率的提高、木糖醇積累的消除等方面進行了一系列代謝工程研究，并利用基因工程技術(shù)將一些真菌的木糖轉(zhuǎn)運酶在釀酒酵母中進行表達，選擇木糖異構(gòu)酶(XI)途徑或木糖還原-木糖醇氧化途徑(XR-XDH)進行木酮糖轉(zhuǎn)化，并將磷酸戊糖下游代謝路徑進行修飾以強化木糖代謝轉(zhuǎn)化乙醇的能力，得到了一些高效的木糖代謝重組發(fā)酵微生物。
[0004]然而，現(xiàn)有公開的C5/C6共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法仍然無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的需要:
[0005]專利CN1966694A公開了一種利用重組釀酒酵母NAN127發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)酒精的方法，包括種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)和種子發(fā)酵的步驟，其中種子培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)采用YERD培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)為葡萄糖、木糖、蛋白胨的混合物。
[0006]專利CNlOl 165166A中報道了利用熱帶假絲酵母Candida Tropicalis及其馴化菌株對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進行發(fā)酵，能夠代謝葡萄糖產(chǎn)乙醇并轉(zhuǎn)化木糖成木糖醇，培養(yǎng)基選擇酵母浸膏、麥芽提取物、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、胰蛋白胨。
[0007]專利W0200851348A、W0200958927A、W0200958938A 中公開了使用經(jīng)過改造的Zymomonas mobilis生產(chǎn)乙醇的方法,種子培養(yǎng)物在SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并且最終培養(yǎng)物包含一定PH條件下的葡萄糖和木糖的混合配制物。
[0008]專利W09742307A中報道了用于將木糖發(fā)酵為乙醇的穩(wěn)定的重組酵母，其中采用YEro培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后的重組酵母投入葡萄糖和木糖的混合物中。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中所公開的發(fā)酵微生物發(fā)酵原料均使用實驗配制物，在其披露的菌株擴大培養(yǎng)以及發(fā)酵條件下菌體生長慢，發(fā)酵時間長，轉(zhuǎn)化率低，無法實現(xiàn)大規(guī)模的乙醇生產(chǎn)，不能滿足利用現(xiàn)有菌株從 木質(zhì)纖維素產(chǎn)生乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0010]因此，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，公開了一種大規(guī)模從含有五碳糖和六碳糖物質(zhì)共發(fā)酵生產(chǎn)獲得乙醇的方法以及從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵制備生產(chǎn)乙醇的工業(yè)化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明目的是一方面提供了生產(chǎn)乙醇的方法，解決了 C5/C6共發(fā)酵微生物菌體生長慢，發(fā)酵時間長，乙醇轉(zhuǎn)化率低的缺陷。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供了一種擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，并且提供了一種C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基。
[0013]另一方面本發(fā)明還提供了一種從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，降低了乙醇的生產(chǎn)成本,實現(xiàn)了木質(zhì)纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0014]本發(fā)明首先提供了一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12_24h，接種擴大培養(yǎng),將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1-10%。
[0015]本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h至(0.1-0.5) X 109/ml，接種擴大培養(yǎng)至(0.1-1) X 109/ml，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵液中按重量百分比含有甸萄糖1_25%、木糖1-10%。
[0016]本發(fā)所述的發(fā)酵液中葡萄糖含量優(yōu)選為5-20%，更優(yōu)選為6-12%，木糖含量優(yōu)選為3-8%,更優(yōu)選為3-6%。
[0017]在本發(fā)明的一個實施方式中所述的發(fā)酵培養(yǎng)液為木質(zhì)纖維素原料酶解液，其中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1_10%，優(yōu)選的葡萄糖含量為5-20%，更優(yōu)選為6-12%，木糖含量優(yōu)選為3-8%，更優(yōu)選為3-6%。同時，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解木質(zhì)纖維素原料酶解液中還允許可以存在少量的乙酸，一定濃度的乙酸可能對微生物細胞產(chǎn)生抑制作用，因而乙酸在發(fā)酵液中的含量優(yōu)選為0.1_1%，更優(yōu)選的范圍為0.1-0.8%。
[0018]本發(fā)明所述的發(fā)酵液中還含有蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素、微量元素中的一種或幾種。其中，蛋白質(zhì)在發(fā)酵液中的含量為3-4g/L，其作用的一方面用于提供微生物生長所需要的氮源；所述游離氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或纈氨酸中的一種或幾種；所述的微量元素包括銅、鈣、鐵、鋅、鉛、銀、鉻、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸鈣中的一種或幾種；所述的維生素包括B族維生素，例如生物素、葉酸。在本申請的優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵液中含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿(其中干物質(zhì)含量為40-60wt%)、魚粉和/或酵母膏，提供蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素和/或微量兀素,其含量為5-10g/L，優(yōu)選為6-8g/L。
[0019]本發(fā)明的另一方面，發(fā)酵液中還含有無機鹽和/或抑制劑。所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優(yōu)選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨，無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L，優(yōu)選1-2.5g/L，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中發(fā)酵液中含有0.5g/L磷酸二氫鉀和2g/L磷酸氫二銨。當發(fā)酵培養(yǎng)過程沒有進入雜菌時，在發(fā)酵液中不需要添加抑菌劑，所述的抑制劑是用來抑制培養(yǎng)基中的雜菌，選自青霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素中的一種或幾種，優(yōu)選青霉素和/或鏈霉素，發(fā)酵液中抑制劑的工作濃度為10-50單位/mL，優(yōu)選為15-25單位/mL，更優(yōu)選為20單位/mL。[0020]本發(fā)明的另一方面提供了一種擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，采用種子培養(yǎng)基將發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h培養(yǎng)至(0.1-0.5) X109/ml，然后接種擴大培養(yǎng)至(0.1-1) XlOVmlo
[0021]本發(fā)明所述的發(fā)酵方法或擴大培養(yǎng)方法中，首先將C5/C6共發(fā)酵微生物采用種子培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)，該步驟的目的是為了快速擴增微生物，達到擴大培養(yǎng)所需要的菌體濃度，所述的種子培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的種子培養(yǎng)基，例如采用YEro培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵微生物，該步驟中優(yōu)選培養(yǎng)時間為12-20h，特別特優(yōu)的培養(yǎng)時間為14-16h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，優(yōu)選培養(yǎng)至(0.2-0.25) X 109/ml，該步驟為后面的擴大培養(yǎng)提供條件。
[0022]本發(fā)明中所述擴大培養(yǎng)能夠為后續(xù)發(fā)酵提供足夠的微生物菌數(shù)，其中擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基(即擴培液)是微生物獲得生存的營養(yǎng)來源，對微生物生長繁殖、酶的活性與產(chǎn)量都有直接的影響。所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種，并且培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計在2-10%，優(yōu)選含量為4-6%。優(yōu)選的，擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有4%葡萄糖(重量百分比)的培養(yǎng)基或以葡萄糖含量為4% (重量百分比)的玉米糖化醪或糖蜜。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述的培養(yǎng)基可以為木質(zhì)纖維素原料酶解液，其中酶解液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1_10%，優(yōu)選的葡萄糖含量為5-20%，更優(yōu)選為6-12%，木糖含量優(yōu)選為3-8%，更優(yōu)選為3-6%，作為培養(yǎng)基時，其稀釋濃度為10-75% (重量百分比)，優(yōu)選的培養(yǎng)基為20-30%稀釋后的木質(zhì)纖維素原料酶解液。所述培養(yǎng)基中和發(fā)酵液中還含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿(其中干物質(zhì)含量為40-60wt%)、魚粉和/或酵母膏，其含量為5-10g/L，優(yōu)選為8-10g/L，其作用的一方面用于提供微生物生長所需要的氮源、包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或纈氨酸的游離氨基酸、包括銅、鈣、鐵、鋅、鉛、銀、鉻、燕酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸鈣中的微量元素以及包括B族維生素在內(nèi)的維生素。培養(yǎng)基中還可以含有尿素、無機鹽和/或抑制劑，所述的尿素的含量為2-5g/L，優(yōu)選為3-4g/L，所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優(yōu)選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨，無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L,優(yōu)選l_3g/L,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中發(fā)酵液中含有
1.5g/L磷酸二氫鉀和1.5g/L磷酸氫二銨。通常情況下，微生物擴大發(fā)酵的過程沒有雜菌進入時不需要添加抑菌劑，所述的抑制劑是用來抑制培養(yǎng)基中的雜菌，選自青霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素中的一種或幾種，優(yōu)選青霉素或/鏈霉素，發(fā)酵液中抑制劑的工作濃度為10-50單位/mL，優(yōu)選為15-25單位/mL，更優(yōu)選為20單位/mL。
[0023]本發(fā)明另一個目的是提供一種C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，包括:(1)蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種；(2)黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿(其中干物質(zhì)含量為40-60wt%、魚粉或酵母膏中的一種或幾種，其含量為5-10g/L，優(yōu)選為6-8g/L ；(3)任選的尿素，在培養(yǎng)基中含量可以為2_5g/L，優(yōu)選為3-4g/L ; (4 )無機鹽，選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優(yōu)選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨，無機鹽在培養(yǎng)基中的含量為0.5-4g/L，優(yōu)選l-3g/L ;(5)任選的抑制劑，選自青霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素中的一種或幾種，優(yōu)選青霉素或/鏈霉素，抑制劑在培養(yǎng)基中的工作濃度為10-50單位/mL，優(yōu)選為15-25單位/mL，更優(yōu)選為20單位/mL，所述培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計在2-10%，優(yōu)選含量為4-6%。
[0024]本發(fā)明所述的擴大培養(yǎng)步驟中種子罐的級數(shù)對發(fā)酵同樣產(chǎn)生影響，級數(shù)少可減少種子罐污染雜菌的機會，減少消毒、值班工作量以及減少因種子罐生長異常而造成發(fā)酵的波動。本發(fā)明所述的擴大培養(yǎng)可以采用二級擴培、三級擴培或四級擴培。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，采用三級擴大培養(yǎng)方式，搖瓶種子培養(yǎng)后的發(fā)酵微生物接至50L擴培發(fā)酵罐，12_24h擴培至(0.1-0.5)父1071111，之后移至50(^擴培罐中擴培12_24h，擴培至(0.1-0.5) X109/ml，移至5立方擴培罐中，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml ;在本發(fā)明的另一個實施方式中，采用四級擴培的方式，搖瓶種子培養(yǎng)后的發(fā)酵微生物接種至50L擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5)父1071111，之后移至5001^擴培罐中擴培12_24h，擴培至(0.1-0.5) X109/ml，移至 5 立方擴培罐，12-24h 擴培至(0.1-0.5) X109/ml，移至 30 立方擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml。接種到擴大培養(yǎng)的微生物接種量可以為種子培養(yǎng)的5-20%，優(yōu)選為5-10%。[0025]微生物擴大培養(yǎng)和發(fā)酵條件中控制通氣條件時，應(yīng)考慮到既能滿足菌種生長與合成酶的不同要求，又要節(jié)省電耗，以提高經(jīng)濟效益。通氣可以供給大量的氧，而攪拌則能使通氣的效果更好，并且攪拌有利于熱交換，使培養(yǎng)液的溫度較一致，有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的分散。此外，選用擋板可使攪拌效果更好。在培養(yǎng)階段的各個時期的通氣量，可以根據(jù)菌種的特性、罐的結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)基的性質(zhì)通過試驗確定。在本發(fā)明的一個實施方式中擴培通氣量應(yīng)該控制在0.1-0.5vvm,每小時10_20min,優(yōu)選的通氣量控制在0.1vvm,每小時20min,擴培攪拌轉(zhuǎn)速可以控制在50-100r/min，特別優(yōu)選的攪拌速度為70r/min，發(fā)酵2_4h攪拌一次，每次5-20min,特別優(yōu)選4h攪拌一次,每次lOmin。
[0026]同時，本發(fā)明所述的微生物擴大培養(yǎng)和發(fā)酵條件中溫度可以選擇微生物生長的適宜溫度，例如在25-38°C范圍內(nèi)，在此溫度范圍內(nèi)，微生物生長、繁殖最快。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述的微生物擴大培養(yǎng)步驟中，溫度控制在25-35°C范圍內(nèi)，優(yōu)選在25-32°C，特別優(yōu)選在28-32°C，所述的發(fā)酵過程溫度控制在28-35°C范圍內(nèi)，優(yōu)選在28-32°C。如果所培養(yǎng)的微生物能承受稍高一些的溫度進行生長、繁殖，可減少污染雜菌的機會，減少夏季培養(yǎng)所需降溫的輔助設(shè)備，對工業(yè)生產(chǎn)有很大的好處，例如在低于45°C條件下。處于遲滯期的細菌對于溫度的影響十分敏感，將其置于最適生長溫度附近，可以縮短其生長的遲滯期；將其置于較低的溫度，則會延長其緩慢期；而且孢子萌發(fā)的時間在一定溫度范圍內(nèi)也隨溫度的上升而縮短。處于對數(shù)生長期的細菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養(yǎng)，即使在發(fā)酵過程中升溫，其升溫的破壞作用也顯得較弱。
[0027]培養(yǎng)基的氫離子濃度對微生物的生命活動有顯著影響。各種微生物都有自己生長與合成酶的最適PH值。同一菌種合成酶的類型與酶系組成可隨pH值的改變而產(chǎn)生不同程度的變化。本發(fā)明所述的微生物擴大培養(yǎng)和發(fā)酵條件中，PH值應(yīng)該保持在pH5.0-7.0的范圍內(nèi)，在一個優(yōu)選的實施方式中，pH值應(yīng)該保持在pH4-6.5的范圍內(nèi)。本發(fā)明所述調(diào)節(jié)pH值的方法有三種，使用酸堿溶液、緩沖液以及各種生理緩沖劑(如生理酸性與生理堿性的鹽類)，優(yōu)選使用堿溶液進行調(diào)節(jié)，包括氨水、氫氧化鈉、碳酸鈉和碳酸氫鈉。
[0028]本發(fā)明在一個【具體實施方式】中提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h培養(yǎng)至(0.1-0.5) X 109/ml，接種量5%_20%接種擴大培養(yǎng)至(0.2-0.3) X 109/ml，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米漿、
1.5g/L磷酸二氫鉀和1.5g/L磷酸氫二銨。其中所述的擴大培養(yǎng)采用三級擴培或四級擴培。優(yōu)選三級擴大培養(yǎng)方式為種子培養(yǎng)后的發(fā)酵微生物接至50L擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，移至 500L 擴培罐中擴培 12_24h，擴培至(0.1-0.5) X109/ml，移至 5立方擴培罐中，12-24h擴培至(0.1-0.5) XlO9Ail ;采用四級擴培的方式，種子培養(yǎng)后的發(fā)酵微生物接種至50L擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，移至500L擴培罐中擴培12-24h，擴培至(0.1-0.5) X109/ml，移至 5 立方擴培罐，12_24h 擴培至(0.1-0.5) XlO9/ml，移至30立方擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X109/ml。
[0029]本發(fā)明還提供了一種從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵制備乙醇的方法，包括:(1)將含木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過酶解處理后得到木質(zhì)纖維素原料酶解液；(2)采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h ； (3)接種擴大培養(yǎng)；(4)將擴大培養(yǎng)后的微生物移至木質(zhì)纖維素原料酶解液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇。
[0030]本發(fā)明還提供了一種從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵制備乙醇的方法，包括:(1)將含木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過酶解處理后得到木質(zhì)纖維素原料酶解液；(2)采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h培養(yǎng)至(0.1-0.5) X 109/ml ；(3)接種擴大培養(yǎng)至(0.1-1) XlO9Ail ; (4)將擴大培養(yǎng)后的微生物移至木質(zhì)纖維素原料酶解液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇。
[0031] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵制備乙醇的方法步驟(4)中發(fā)酵過程還加入蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素、微量元素中的一種或幾種。其中，蛋白質(zhì)在發(fā)酵液中的含量為3-4g/L ;所述游離氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或纈氨酸中的一種或幾種；所述的微量元素包括銅、鈣、鐵、鋅、鉛、銀、鉻、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸鈣中的一種或幾種；所述的維生素包括B族維生素，例如生物素、葉酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，發(fā)酵過程中加入黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿(其中干物質(zhì)含量為40-60wt%)、魚粉和/或酵母膏，提供蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素和/或微量元素，其含量為5-10g/L，優(yōu)選為6-8g/L。優(yōu)選的，發(fā)酵過程中還加入有無機鹽和/或抑制劑。所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，優(yōu)選為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二銨，無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L,優(yōu)選1-2.5g/L,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中發(fā)酵液中含有0.5g/L磷酸二氫鉀和2g/L磷酸氫二銨。通常情況下，微生物擴大發(fā)酵的過程沒有雜菌進入時不需要添加抑菌劑，所述的抑制劑是用來抑制培養(yǎng)基中的雜菌，選自青霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、氣霉素、土霉素、四環(huán)素中的一種或幾種，優(yōu)選青霉素或/鏈霉素，發(fā)酵液中抑制劑的工作濃度為10-50單位/mL，優(yōu)選為15-25單位/mL，更優(yōu)選為20單位/mL。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，從含木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵制備乙醇的方法還包括清洗、預(yù)處理的步驟，所述的清洗包括采用水洗、篩分、風選等方式。所述的預(yù)處理步驟包括本領(lǐng)域常用的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法，例如蒸煮法、酸浸法、堿處理、蒸汽爆破、膠體磨粉碎
坐寸ο
[0033]本發(fā)明中所指C5/C6共發(fā)酵微生物指自然界分離得到的微生物以及經(jīng)過遺傳工程改造后的C5/C6共發(fā)酵微生物，包括細菌、真菌和酵母釀酒。酵母包括釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae、嗜縣管囊酵母 Pachysolen tannophilus、樹干畢赤酵母 Pichia stipitis、休哈塔假絲酵母 Candida shehatae、酒香酵母 Brettanomycesnaardenensis、纖細假絲酵母Candida tenuis、熱帶假絲酵母Candida tropicalis和賽溝畢赤酵母Pichia segobiensis ;真菌包括多動擬桿菌Bacteroidespolypragmatus、菊歐文氏桿菌Erwinia chrysanthem、植物克雷伯桿菌Klebsiella planticola、嗜熱厭氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus、球狀螺旋體 Spirochaeta coccoidessp.、植物發(fā)酵梭菌Clostridium phytofermentassp.;真菌包括尖抱鍵刀菌Fusarium oxysporum、粗糖脈抱菌 Neurospora crassa 和燕麥鍵刀菌 Fusarium avenaceum。
[0034]經(jīng)過遺傳工程改造的微生物包括重組釀酒酵母S.cerevisiae、重組運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis,以及重組大腸桿菌Escherichia coli。重組釀酒酵母S.cerevisiae是通過真菌的木糖轉(zhuǎn)運酶在釀酒酵母中進行表達，選擇木糖異構(gòu)酶(XI)途徑或木糖還原-木糖醇氧化途徑(XR-XDH)進行木酮糖轉(zhuǎn)化，并將磷酸戊糖下游代謝路徑進行修飾以強化木糖代謝轉(zhuǎn)化乙醇的能力，可利用的釀酒酵母菌記載在專利W09742307A、W09513362A、US20110027847、CN1966694A、CN101205525A 所公開的菌株；對運動發(fā)酵單胞菌 Zymomonasmobilis改造可將E.coli的xylA(木糖異構(gòu)酶基因)、xylB (木酮糖激酶基因)、talB (轉(zhuǎn)酮醇酶基因)、tktA(轉(zhuǎn)醛醇酶基因)導(dǎo)入到Z.mobilis中，例如專利US5843760、US5514583、W0200851348A、W0200958927A、W0200944868A 或 W0200958938A ;將含有 PET 操縱子(攜帶運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫氫酶和乙醇脫氫酶基因)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli菌株可以使重組E.coli的已糖和戊糖代謝形成的中心代謝物-丙酮酸轉(zhuǎn)向乙醇生產(chǎn)，例如專利CN101875912A中所報道的菌株。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，優(yōu)選的C5/C6共發(fā)酵微生物選自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis和/或大腸桿菌E.coli,特別優(yōu)選為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、運動發(fā)酵單胞菌Zymomonasmobilis。
[0035]本發(fā)明中所指的YEH)培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基成分為酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，經(jīng)分裝滅菌后混合制備得到。
[0036]本發(fā)明中所指的含木質(zhì)纖維素原料包括玉米秸桿、玉米芯、硬木、軟木、堅果殼、草、紙、大麥桿、小麥桿、樹葉、棉籽絮、報紙、柳枝、燕麥殼等。從結(jié)構(gòu)上看,木質(zhì)纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。在優(yōu)選實施方案中，含木素纖維素原料包含至少30wt%，優(yōu)選至少50wt%，更優(yōu)選至少70wt%，甚至更優(yōu)選至少90wt%的木質(zhì)纖維素。應(yīng)理解的是，含木質(zhì)纖維素原料中還可以包含其它組分，如蛋白質(zhì)材料、淀粉、糖，如可發(fā)酵的糖和/或不可發(fā)酵的糖。優(yōu)選的，本發(fā)明中所指含木質(zhì)纖維素原料為玉米秸桿。
[0037]本發(fā)明中所述的酶解過程中的酶包括:纖維素酶、半纖維素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶等，其中纖維素酶包括但不限于纖維二糖水解酶(纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II)以及內(nèi)切葡聚糖和葡糖苷酶。
[0038]在本申請的一個實施方式中，從發(fā)酵液中分離乙醇可以采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，例如采用蒸餾，可采用本領(lǐng)域中所描述的常規(guī)蒸餾設(shè)備，例如具有雙流塔板和橫流塔板的蒸餾塔。然而，因為發(fā)酵含酒精產(chǎn)物的高懸浮固體含量，一般來說，雙流篩塔板或橫流閥塔板是優(yōu)選的。在各種優(yōu)選的實施方案中，包括橫流閥塔板的塔是優(yōu)選的，因為通過橫流閥塔板往往提供更聞的極限負荷比和更聞的效率。
[0039]本發(fā)明所述的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法能夠使木糖的利用率和總糖的轉(zhuǎn)化率達到70%以上，發(fā)酵后發(fā)酵液中含有乙醇的濃度在50g/L左右，克服了菌體生長慢，發(fā)酵時間長，轉(zhuǎn)化率低的缺陷，有利于實現(xiàn)大規(guī)模的纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0040]實施例1假絲酵母二級擴培發(fā)酵乙醇實驗
[0041]菌種:熱帶假絲酵母Candida tropicalis,市售獲得
[0042]擴培培養(yǎng)基:一級與二級擴培相同，為4%葡萄糖擴培培養(yǎng)基，含有葡萄糖4%(質(zhì)量百分比)、玉米漿(干物質(zhì)含量40%)15g/L、KH2P04l.5g/L、(NH4)2HPO4L 5g/L ;去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合，加入3g/L尿素。
[0043]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖8wt%、木糖 4.5wt%、KH2PO40.5g/L、(NH4)2HP042g/L ;去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合。
[0044]發(fā)酵方法:配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種至YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h擴培至(0.2-0.3) X 109/ml，按接種量5%接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30° C，轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng)時間16h，第一級菌體5%接種至第二級擴培培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴培溫度30° C，轉(zhuǎn)速200rpm，擴培16h后菌體以10%接種至含有發(fā)酵液的發(fā)酵罐中發(fā)酵72h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度以及殘留葡萄糖和木糖含量。
[0045]實施例2-4釀酒酵母擴培發(fā)酵乙醇實驗(不同擴培培養(yǎng)基與同一發(fā)酵培養(yǎng)基比較試驗)
[0046]菌種:重組釀酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)(如 Cellulosic ethanolproduction from AFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae424A (LNH-ST)，M.ff.Lau, B.E.Dale, Proc Natl Acad Sci USA, 106(2009)，pp.1368-1373 ；Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethanol using commercialenzymes and Saccharomyces cerevisiae424A(LNH-ST),M.Jin,M.ff.Lau, V.Balan,B.E.Dale, Bioresour Technol, 101 (2010)，pp.8171-8178 等報道)
[0047]擴培培養(yǎng)基:
[0048]實施例2采用木質(zhì)纖維素原料酶解液擴培培養(yǎng)基:其中含有用水稀釋至30wt%木質(zhì)纖維素原料酶解液、玉米漿(干物質(zhì)含量40%) 15g/L、KH2PO4L 5g/L、(NH4)2HPO4L 5g/L，去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合，加入3g/L尿素；
[0049]實施例3采用4%葡萄糖擴培培養(yǎng)基:其中含葡萄糖4wt%，玉米漿(干物質(zhì)含量40%) 15g/L、KH2PO4L 5g/L、(NH4)2HPO4L 5g/L，去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合，加入3g/L尿素；
[0050]實施例4采用玉米糖化醪擴培培養(yǎng)基:含玉米糖化醪4wt%，滅菌后加入3g/L尿素；
[0051]發(fā)酵培養(yǎng)基:
[0052]實施例2-4均采用木質(zhì)纖維素原料酶解液進行發(fā)酵，含有用水稀釋至30wt%木質(zhì)纖維素原料酶解液、玉米漿(干物質(zhì)含量40wt%)7.5g/L、KH2P040.5g/L，(NH4) 2HP042g/L，發(fā)酵開始前調(diào)節(jié)PH為6.0 ;
[0053] 發(fā)酵方法:配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種至YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)14h擴培至(0.2-0.3) X 109/ml，按接種量5%接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30° C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時間12_14h，以10%的接種量接入發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵72h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度以及殘留葡萄糖和木糖含量。
[0054]實施例5-6釀酒酵母二級擴培發(fā)酵乙醇實驗(同一擴培培養(yǎng)基和不同發(fā)酵培養(yǎng)基比較試驗)
[0055]菌種:重組釀酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)，同實施例2-4中菌株來源
[0056]擴培培養(yǎng)基:4%葡萄糖擴培培養(yǎng)基，其中葡萄糖含量4wt%’玉米漿15g/L，KH2PO4L 5g/L，(NH4)2HPO4L 5g/L，去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合加入3g/L尿素；
[0057]發(fā)酵培養(yǎng)基:
[0058]實施例5:葡萄糖 10wt%、木糖 5wt%、玉米衆(zhòng) 7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4) 2HP042g/L，用去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合。發(fā)酵開始前調(diào)節(jié)pH為6.0。
[0059]實施例6:木質(zhì)纖維素酶解液(含葡萄糖9.5wt%、木糖4.5wt%)、玉米衆(zhòng)7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4) 2HP042g/L，去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合。發(fā)酵開始前調(diào)節(jié)PH為6.0。
[0060]發(fā)酵方法:配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種至YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)14h擴培至(0.2-0.3) X 109/ml，按接種量5%接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30° C，轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng)時間14h，以10%的接種量接入發(fā)酵搖瓶中，調(diào)節(jié)pH至6.0，發(fā)酵72h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度以及殘留葡萄糖和木糖含量。
[0061 ] 實施例7運動發(fā)酵單胞菌二級擴培發(fā)酵試驗
[0062]菌種:運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis,在Z.mobilis中同時表達E.coli的木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因(xylB)、轉(zhuǎn)醛酶基因(tal)、轉(zhuǎn)酮酶基因(tktA)，將上述基因分為2組，即xylA和xylB, tal和tktA,組成2個操縱子,分別置于Z.mobilis自身的3-P-甘油醛脫氫酶啟動子和烯醇酶啟動子下，并將這2個操縱子構(gòu)建成I個質(zhì)粒。
[0063]擴培培養(yǎng)基:4%葡萄糖擴培培養(yǎng)基，含有葡萄糖含量4% (質(zhì)量百分比)、玉米漿(40%干固含量)15g/L、KH2PO4L 5g/L、(NH4)2HPO4L 5g/L ;去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌,冷卻后混合,加入3g/L尿素。
[0064]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10wt%、木糖10wt%、玉米衆(zhòng)7.5g/L、KH2PO40.5g/L、(NH4) 2HP042g/L，去離子水或軟化水配置溶液，分裝滅菌，冷卻后混合，。
[0065]發(fā)酵方法:配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種至YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h擴培至(0.2-0.3) X109/ml，按接種量5%接種到含有擴培培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，擴培溫度37° C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時間16h，第一級菌體5%接種至二級擴培培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴培溫度37° C，轉(zhuǎn)速200rpm，擴培結(jié)束接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶中發(fā)酵72h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度以及殘留葡萄糖和木糖含量。
[0066]實施例8假絲酵母擴培發(fā)酵乙醇對照實驗
[0067]采用CN101165166A中公開的方法
[0068]菌種:熱帶假絲酵母Candida tropicalis
[0069]培養(yǎng)基:酵母浸膏3g/L、KH2P043g/L、麥芽提取物 3g/L、(NH4) 2SO4Ig/L、MgSO4.7H200.5g/L、胰蛋白胨3g/L，其余為木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物原液，pH5.0-5.5。
[0070]培養(yǎng)條件:連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，30°C，80rpm，接種量為10%。[0071]實施例9釀酒酵母發(fā)酵玉米秸桿制備乙醇實驗(三級擴培)
[0072]擴培培養(yǎng)基:一級及二級擴培培養(yǎng)基參考實施例4，三級擴培培養(yǎng)基參考實施例2。
[0073]發(fā)酵培養(yǎng)基:參考實施例2-4。
[0074]步驟(1):將玉米秸桿破碎為粒度為10-100_的顆粒，將原料投入螺旋喂料器，對其進行擠壓脫水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保證纖維素原料不斷進入處理容器的同時還能抵御容器內(nèi)的蒸汽外泄；
[0075]步驟(2):在步驟I中形成的料塞從螺旋喂料器處理后，向纖維素原料中混入其質(zhì)量2%的稀釋硫酸溶液，進入酸混合罐混合后得到酸性纖維素原料；
[0076]步驟(3):步驟2中的酸性纖維素原料在蒸煮處理容器中，與0.6MPa(G)的低壓蒸汽接觸進行處理，處理時間在15_25min之間，然后按照一定頻率間歇泄壓排放的方式排出容器，此過程可以打開纖維素原料的結(jié)構(gòu)，使半纖維素部分降解，部分纖維素裸露在表面。
[0077]步驟(4):將生物質(zhì)處理產(chǎn)物水洗，調(diào)節(jié)pH值為5.0，加熱至50°C后，以每克產(chǎn)物的干重計，加入20-50濾紙酶活力單位的纖維素酶計算，擠入纖維素酶(諾維信有限公司提供)，并在50°C下保溫混合攪拌72h，得到酶解液。
[0078]步驟(5):配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)14h擴培至(0.2-0.3) XioVml,按接種量5%，將菌體接至50L擴培發(fā)酵罐中，14h擴培至(0.2-0.3) X109/ml，移至500L發(fā)酵罐中擴培16h，擴培至(0.2-0.3) X109/ml，之后移至5立方擴培發(fā)酵罐中，16h擴培至(0.2-0.3) X 109/ml，移至30立方發(fā)酵罐中發(fā)酵72h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度。
[0079]實施例10釀酒酵母發(fā)酵玉米秸桿制備乙醇實驗(四級擴培)
[0080]擴培培養(yǎng)基:一級及二級擴培培養(yǎng)基參考實施例4，三級及四級擴培培養(yǎng)基參考實施例2。
[0081]發(fā)酵培養(yǎng)基:參考實施例2-4。
[0082]步驟(1):將玉米秸桿破碎為粒度為IO-1OOmm的顆粒，將原料投入螺旋喂料器，對其進行擠壓脫水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保證纖維素原料不斷進入處理容器的同時還能抵御容器內(nèi)的蒸汽外泄；
[0083]步驟(2):在步驟I中形成的料塞從螺旋喂料器處理后，向纖維素原料中混入其質(zhì)量2%的稀釋硫酸溶液，進入酸混合罐混合后得到酸性纖維素原料；
[0084]步驟(3):步驟2中的酸性纖維素原料在蒸煮處理容器中，與0.6MPaG的低壓蒸汽接觸進行處理，處理時間在15_25min之間，然后按照一定頻率間歇泄壓排放的方式排出容器，此過程可以打開纖維素原料的結(jié)構(gòu)，使半纖維素部分降解，部分纖維素裸露在表面。
[0085]步驟(4):將生物質(zhì)處理產(chǎn)物水洗，調(diào)節(jié)pH值為5.0，加熱至50°C后，以每克產(chǎn)物的干重計，加入20-50濾紙酶活力單位的纖維素酶計算，擠入纖維素酶(諾維信有限公司提供)，并在50°C下保溫混合72h，得到酶解液。
[0086]步驟(5):配制YEro培養(yǎng)基，將酵母菌體接種YEro培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h擴培至(0.2-0.3) XioVml,按接種量 5%，接種至 50L 擴培罐，14h 擴培至(0.2-0.3) X109/ml，移至500L擴培罐中擴培14h，擴培至(0.2-0.3) X 109/ml，移至5立方擴培罐，16h擴培至(0.2-0.3) X109/ml，移至30立方擴培罐，16h擴培至(0.2-0.3) X109/ml，移至100立方發(fā)酵罐中發(fā)酵72h，
[0087]獲得發(fā)酵產(chǎn)物，檢測乙醇濃度。
[0088]實施例11試驗結(jié)果
[0089]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h，接種至擴大培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵培養(yǎng)液獲得乙醇，其中發(fā)酵培養(yǎng)液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1-10%。
2.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)液為木質(zhì)纖維素原料酶解液。
3.權(quán)利要求1-2任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)液中含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉或酵母膏一種或幾種，含量為5-10g/L。
4.權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉或酵母膏一種或幾種的含量為6-8g/L。
5.權(quán)利要求3-4任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)液中含有玉米漿。
6.權(quán)利要求1-5任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)液中含有無機鹽，所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L。
7.權(quán)利要求6任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)液中含有無機鹽，所述的無機鹽在發(fā)酵液中的含量為1-2.5g/L。
8.權(quán)利要求6-7任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)液中含有無機鹽，所述的無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨。
9.權(quán)利要求1-8任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于擴大培養(yǎng)采用二級擴大培養(yǎng)、三級擴大培養(yǎng)或四級擴大培養(yǎng)。
10.權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于采用三級擴大培養(yǎng)=YEro培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種5-20%的微生物至50L擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，移至500L擴培罐中擴培12-24h，擴培至(0.1-0.5)父1071111，移至5立方擴培罐中，12-2411擴培至(0.1-0.5) XlOVmlo
11.權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于采用四級擴培，YEH)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種5-20%的微生物至50L擴培罐，12-24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，之后移至500L擴培罐中擴培12-24h，擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，移至5立方擴培罐，12_24h擴培至(0.1-0.5) X 109/ml，移至 30 立方擴培罐，12_24h 擴培至(0.1-0.5) X 109/ml。
12.權(quán)利要求1-11任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種，并且培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計含量2-10%。
13.權(quán)利要求12任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計含量為4-6%。
14.權(quán)利要求12所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為按重量百分比含有葡萄糖1-25%和木糖1-10%的木質(zhì)纖維素原料酶解液。
15.權(quán)利要求12-14所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、蛋白胨和/或酵母膏中的一種或幾種，其含量為5-10g/L。
16.權(quán)利要求12-15任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還含有尿素、無機鹽，所述的尿素的含量為2-5g/L，所述的無機鹽在發(fā)酵液中的含量為 0.5-4g/L。
17.權(quán)利要求16所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種。
18.權(quán)利要求17所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在所述的無機鹽為1.5g/L磷酸二氫鉀和1.5g/L磷酸氫二銨。
19.權(quán)利要求1-18任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)步驟中pH 值為 ρΗ4-6.5。
20.權(quán)利要求1-19任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基。
21.權(quán)利要求1-20所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共發(fā)酵微生物為細菌、真菌和酵母釀酒中的一種或幾種。
22.權(quán)利要求21所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共發(fā)酵微生物選自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜鞋管囊酵母Pachysolentannophilus、樹干畢赤酵母 Pichia stipitis、休哈塔假絲酵母 Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纖細假絲酵母Candida tenuis、熱帶假絲酵母Candida tropical is 和賽溝畢赤酵母 Pichia segobiensis、多動擬桿菌 Bacteroidespolypragmatus、菊歐文氏桿菌 Erwinia chrysanthem、植物克雷伯桿菌 KlebsiellaPlanticola、嗜熱厭氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanoIicus、球狀螺旋體 Spirochaetacoccoidessp.、植物發(fā)酵 梭菌 Clostridiumphytofermentassp.、尖抱鍵刀菌 Fusariumoxysporum、粗糖脈抱菌Neurospora crassa和燕麥鍵刀菌Fusarium avenaceum、運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis和大腸桿菌Escherichia coli中的一種或幾種。
23.權(quán)利要求22所述的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在所述的于所述的C5/C6共發(fā)酵微生物選自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae和運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis。
24.一種生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于包括采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h，接種擴大培養(yǎng),將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵培養(yǎng)液獲得乙醇，其中發(fā)酵培養(yǎng)液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米漿、l-2g/L磷酸二氫鉀和l_2g/L磷酸氫二銨。
25.一種生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h，接種量5%-20%接種擴大培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵培養(yǎng)液中為木質(zhì)纖維素原料酶解液，并且發(fā)酵培養(yǎng)液中含有5-10g/L玉米漿、l-2g/L磷酸二氫鉀和l_2g/L磷酸氫二銨。
26.—種生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h 培養(yǎng)至(0.1-0.5) X 109/ml，接種量 5%_20% 接種擴大培養(yǎng)至(0.2-0.3) X 109/ml，將擴大培養(yǎng)后的微生物移至發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇，其中發(fā)酵培養(yǎng)液中按重量百分比含有葡萄糖1_25%、木糖1-10%、5-10g/L玉米漿、l-2g/L磷酸二氫鉀和l-2g/L磷酸氫二銨。
27.權(quán)利要求24-26任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)步驟中培養(yǎng)基含有以質(zhì)量百分比計4-6%葡萄糖、10-20g/L玉米漿、KH2P04l-2g/L,(NH4) 2HP04l-2g/L，尿素 l-3g/L。
28.權(quán)利要求24-26任意項所述的生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)步驟中的培養(yǎng)基含有玉米糖化醪，尿素l_3g/L，所述玉米糖化醪濃度以葡萄糖計質(zhì)量百分比為4-6% ο
29.一種擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，其特征在于采用種子培養(yǎng)基將發(fā)酵微生物培養(yǎng)12_24h，接種擴大培養(yǎng)，所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種，并且培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計含量2-10%。
30.權(quán)利要求29所述的一種擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法,其特征在于米用種子培養(yǎng)基將發(fā)酵微生物培養(yǎng)2-24h培養(yǎng)至(0.1-0.5) X 109/ml,接種擴大培養(yǎng)至(0.1-1) XlOVmlo
31.權(quán)利要求29-30任意項所述的擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計含量為4-6%。
32.權(quán)利要求29-31任意項所述的擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為按重量百分比含有木糖1-10%的木質(zhì)纖維素原料酶解液。
33.權(quán)利要求29-32任意項所述的擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還含有黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉和/或酵母膏中的一種或幾種，其含量為5-10g/L。
34.權(quán)利要求29- 33任意項所述的擴大培養(yǎng)C5/C6共發(fā)酵微生物的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還含有尿素和/或無機鹽，所述的尿素的含量為2-5g/L，所述的無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L。
35.一種用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，包括:(1)玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種；(2)黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉、蛋白胨或酵母膏中的一種或幾種，其在培養(yǎng)基中含量為5-10g/L;任選的含有(3)尿素，其在培養(yǎng)基中含量為2-5g/L; (4)無機鹽，選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，其在培養(yǎng)基中為0.5-4g/L ；(5)任選的含有抑制齊Li，選自青霉素、氣節(jié)青霉素、鏈霉素、氣霉素、土霉素、四環(huán)素中的一種或幾種，所述的抑制劑工作濃度為2-20單位/mL，所述培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計為2-10%。
36.權(quán)利要求35所述的用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基,其特征在于:(2)黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉或酵母膏中的一種或幾種的含量為6-8g/L。
37.權(quán)利要求35-36任意項所述的用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，其特征在于(3)尿素的含量為3_4g/L。
38.權(quán)利要求35-37任意項所述的用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，其特征在于(4)無機鹽的含量為磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨。
39.權(quán)利要求35-38任意項所述的用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中葡萄糖的含量以重量百分比計為4-6%。
40.權(quán)利要求35-39任意項所述的用于C5/C6共發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基，其特征在于(5)抑制劑為青霉素或/鏈霉素，所述的抑制劑工作濃度為2-20單位/mL。
41.一種從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，包括:(1)將含木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過酶解處理后得到木質(zhì)纖維素原料酶解液；(2)采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h ; (3)接種擴大培養(yǎng)；(4)將擴大培養(yǎng)后的微生物移至木質(zhì)纖維素原料酶解液中發(fā)酵24-72h，分離發(fā)酵液獲得乙醇。
42.權(quán)利要求41所述的一種從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于:(2)采用種子培養(yǎng)基將C5/C6共發(fā)酵微生物培養(yǎng)12-24h培養(yǎng)至(0.1-0.5) X 109/ml ;并且(3)接種擴大培養(yǎng)至(0.1-1) XlOVmlo
43.權(quán)利要求41-42任意項所述的從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于:步驟(4)中木質(zhì)纖維素原料酶解液中還加入黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉或酵母膏一種或幾種，含量為5-10g/L。
44.權(quán)利要求43所述的從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于步驟(4)中木質(zhì)纖維素原料酶解液中還加入玉米漿。
45.權(quán)利要求41-44所述的從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于步驟(4)中木質(zhì)纖維素原料酶解液中還加入無機鹽，所述的無機鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，無機鹽在發(fā)酵液中的含量為0.5-4g/L0
46.權(quán)利要求45所述的從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于所述的無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨。
47.權(quán)利要求41-46所述的從含木質(zhì)纖維素原料制備乙醇的方法，其特征在于步驟(3)中擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種；蛋白胨、黃豆餅粉、玉米餅粉、玉米漿、魚粉或酵母膏中的一種或幾種，其在培養(yǎng)基中含量為5-10g/L ;任 選的尿素，其在培養(yǎng)基中含量為2-5g/L ;無機鹽，選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨中的一種或幾種，其在培養(yǎng)基中為 0.5-4g/L。
【文檔編號】C12N1/20GK103898166SQ201210572375
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】李凡, 林鑫, 沈乃東, 張丹, 蘇會波, 彭超, 武國慶, 林海龍, 劉文信, 劉勁松, 李春玲, 袁敬偉, 岳國君 申請人:中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司, 中糧生化能源（肇東）有限公司, 中糧集團有限公司