專利名稱：一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法
技術領域：
本發明屬于植物保護技術領域，涉及一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法。
背景技術：
煙草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)是引起絲瓜疫病的病原菌，在絲瓜生產中為害嚴重。在氣候適宜的條件下，疫病短期即可暴發流行，造成很大的經濟損失。因此，常需要獲得大量無污染的煙草疫霉菌的孢子囊或游動孢子，用于監測各地煙草疫霉菌的致病力、測定各種殺菌劑對其孢子囊和游動孢子的生物學活性，以及測定絲瓜品種的抗性水平等。目前，室內獲得大量煙草疫霉菌孢子囊和游動孢子的方法主要有傳統培養誘導法和新鮮寄主植物材料誘導法2種。傳統培養誘導法將菌絲置于燕麥培養基或黑麥培養基或V8汁培養液，活化培養較長一段時間后，再加入土壤浸出液或者皮氏液，光照條件下誘導產生孢子囊，經低溫處理后產生游動孢子。該方法誘導疫霉菌產生孢子囊需要10天以上，時間長。新鮮寄主植物材料誘導法將活化好的疫霉菌接種到新鮮寄主植物的子葉或果實中，培養一段時間后即可誘導產生孢子囊，經低溫處理后產生游動孢子。該方法所需要的時間較短，但容易遭受細菌的污染，而且植物材料較難獲得。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種簡便、快速誘導煙草疫霉菌產生大量無污染的孢子囊并釋放游動孢子的方法，用于煙草疫霉菌致病力測定、殺菌劑對煙草疫霉菌的生物活性測定以及絲瓜品種對疫病的抗病性鑒定等研究。本發明的目的通過下述技術方案實現一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，包括如下步驟(I)煙草疫霉菌活化將煙草疫霉菌接種于PDA培養基上進行活化培養。(2)制備產生孢子囊的誘導液用水將市場上購買的貝奇(福建)食品有限公司生產的貝奇野菜復合蔬果汁飲料配制成體積濃度15% 25%的貝奇野菜復合蔬果汁液，滅菌后備用；制備質量濃度為O. 05% O. 2%的復合肥溶液，滅菌后備用。(3)誘導產生孢子囊取步驟(I)已活化的煙草疫霉菌接種到步驟(2)制備的體積濃度15% 25%的貝奇野菜復合蔬果汁液中，25°C 30°C黑暗培養2d 4d ;然后倒盡貝奇復合蔬果汁液，換上步驟(2)制備的質量濃度為O. 05% O. 20%的復合肥溶液，于光照強度500Lux 700Lux的白色日光燈下25V 30°C連續光照培養2d 4d，即可誘導產生孢子囊。(4)誘導釋放游動孢子將步驟(3)經過誘導的煙草疫霉菌4°C 10°C放置20min 40min，然后置于25°C 30°C，30min后即可釋放出大量的游動孢子。步驟(I)中所述的活化培養為25°C 30°C黑暗培養2d 4d ;更優選的所述的活化培養的溫度為27°C。步驟(2)中所述的水優選為雙蒸水。步驟(2)中所述的貝奇野菜復合蔬果汁的體積濃度優選為20%。步驟(2)所述的復合肥優選為硫酸鉀型15-15-15復合肥，所述的復合肥溶液的質量濃度優選為O. 1%。步驟(2)中所述的滅菌的條件優選為121°C濕熱滅菌25min。步驟(3)中所述的誘導產生孢子囊的方法優選為取步驟(I)已活化的煙草疫霉菌邊緣菌絲塊置于無菌的培養皿上，加入步驟(2)制備的體積濃度20%的貝奇野菜復合蔬果汁液，使果汁液剛好浸過菌絲塊，27°C黑暗培養2d ;然后傾盡貝奇野菜復合蔬果汁液，換上步驟(2)制備的復合肥溶液，使復合肥溶液也剛好浸過菌絲塊，置于光照強度600Lux的白色日光燈光照培養箱中27°C連續光照培養3d，即可誘導產生大量的孢子囊。步驟(4)中所述的誘導釋放游動孢子的方法優選為將步驟(3)經過誘導的煙草疫霉菌4°C放置30min，然后置于27°C，30min后即可釋放出大量的游動孢子。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)快速本發明的方法可以在5d內獲得大量的煙草疫霉菌的孢子囊和游動孢子，較傳統培養誘導方法相比，誘導周期可以縮短一半；與新鮮寄主植物材料誘導法的誘導周期相當。(2)無污染本發明的誘導液經過滅菌處理，在操作過程中亦無污染源的加入，誘導出的孢子囊和游動孢子均沒有污染。

(3)誘導液可以長期保存備用本發明的誘導液經過滅菌處理，可置于4°C冰箱中保存備用，如有需要即可拿出來使用。


圖1是誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子流程圖。圖2是煙草疫霉菌標準菌株(編號GM3. 567)產生孢子囊的結果圖。圖3是煙草疫霉菌標準菌株(編號GIM3. 567)釋放游動孢子的結果圖。圖4是新鮮絲瓜疫病病樣分離的煙草疫霉菌在誘導液中的生長情況圖。圖5是誘導新鮮絲瓜疫病病樣分離的煙草疫霉菌產生孢子囊的結果圖。圖6是誘導新鮮絲瓜疫病病樣分離的煙草疫霉釋放游動孢子的結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。原材料規格貝奇野菜復合蔬果汁飲料貝奇(福建)食品有限公司市售飲品。20%的貝奇野菜復合蔬果汁液用雙蒸水與貝奇野菜復合蔬果汁飲料按體積比4:1混勻，121°C濕熱滅菌25min后備用。復合肥硫酸鉀型15-15-15復合肥料，挪威海德魯有限公司市售肥料。O. 1%復合肥溶液稱取1. Og的復合肥，溶解于999mL雙蒸水中，121°C濕熱滅菌25min后備用。其它實驗操作所需要的培養皿、PDA培養基、移液器、滅菌鍋、冰箱、蒸餾水、光照培養箱等均為實驗室常規工具或材料。實施例1煙草疫霉菌標準菌株產生孢子囊和游動孢子(I)在超凈工作臺上，將煙草疫霉菌(菌株編號GM3. 567，購自于廣東省微生物菌種保藏中心)接種到PDA培養基上，27°C黑暗培養2d。(2)在超凈工作臺上，用直徑為O. 5cm的打孔器在菌落邊緣處打孔，取I塊菌絲塊置于直徑為6cm的無菌培養皿中，加入體積濃度為20%的貝奇野菜復合蔬果汁液5mL，27°C黑暗培養2d ;然后倒盡果汁液，換上無菌的質量濃度為O. 1%復合肥溶液5mL，置于光照強度600Lux的白色日光燈的光照培養箱(廣東省韶關市泰宏醫療器械有限公司產品，型號LRH-250-G)，27°C連續光照培養3d。(3)將經過上述誘導培養的煙草疫霉菌于4°C冰箱中，放置30min ;然后將其置于27°C培養箱中，30min后收集液體。(4)用量程為2. 5 μ L移液槍吸取O. 2 μ L的液體至于載玻片上，拖成條帶，在4倍鏡視野下計算游動孢子的數量。取樣10次，計算出O. 2μ L液體中游動孢子的平均數，然后換算成每毫升游動孢子懸浮液的濃度。產生的孢子囊和釋放的游動孢子如圖2和圖3所示；經測定釋放的游動孢子數達5. 92 X IO5個孢子/mL，釋放率80%以上。實施例2誘導新鮮絲瓜疫病病樣中分離的煙草疫霉菌菌株產生孢子囊和游動孢子(I)取新鮮發病 的絲瓜疫病病樣標本，用剪刀在病健交界處剪取大小約為2mm X 5mm的組織塊。(2)在超凈工作臺上，將組織塊置于75%酒精中浸30s，然后在5%次氯酸鈉溶液中浸泡漂洗Imin ;爾后用滅菌水換洗3次。在滅菌濾紙上吸干水后,將其轉移到PDA培養基平板上，27 °C黑暗培養4d。(3)待長出菌落后，在超凈工作臺上挑取菌落顏色為白色的邊緣菌絲塊，對其進行菌絲純化，即可獲得煙草疫霉菌。(4)在超凈工作臺上，將純化后的菌株置于體積濃度為20%的貝奇野菜復合蔬果汁液中，使果汁液剛好浸過菌絲塊，27°C黑暗培養2d ;然后傾盡液體，換入滅過菌的質量濃度為O. 1%復合肥溶液，使復合肥溶液亦剛好浸過菌絲塊，置于光照強度600LUX的白色日光燈(廣東省韶關市泰宏醫療器械有限公司產品，型號LRH-250-G)的光照培養箱中，27°C連續光照培養3d。(5)將上述經過誘導培養的菌株置于4°C冰箱中30min,然后放置于27°C培養箱中，30min后收集液體。用移液槍吸取O. 2 μ L的液體至于載玻片上，在4倍鏡視野下計算游動孢子的數量。取樣10次，計算出O. 2 μ L液體中游動孢子的平均數，然后換算成游動孢子懸浮液的濃度。從新鮮絲瓜疫病樣分離純化的煙草疫霉菌在誘導液的生長情況如圖4所示，產生的孢子囊和釋放的游動孢子如圖5和圖6所示。經測定，釋放的游動孢子數1. 91 X IO5個孢子/mL，釋放率80%以上。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包 含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)煙草疫霉菌活化將煙草疫霉菌接種于PDA培養基上進行活化培養； (2)制備產生孢子囊的誘導液用水將市場上購買的貝奇(福建)食品有限公司生產的貝奇野菜復合蔬果汁飲料配制成體積濃度15% 25%的貝奇野菜復合蔬果汁液，滅菌后備用；制備質量濃度為O. 05% O. 2%的復合肥溶液，滅菌后備用； (3)誘導產生孢子囊取步驟(I)已活化的煙草疫霉菌接種到步驟(2)制備的體積濃度15% 25%的貝奇野菜復合蔬果汁液中，25°C 30°C黑暗培養2d 4d ;然后傾盡貝奇復合蔬果汁液，換上步驟(2)制備的質量濃度為O. 05% O. 20%復合肥溶液，于光照強度500Lux 700Lux的白色日光燈下25V 30°C連續光照培養2d 4d，即可誘導產生大量的孢子囊； (4)誘導釋放游動孢子將步驟(3)經過誘導的煙草疫霉菌4°C 10°C放置20min 40min，然后置于25°C 30°C，30min后即可釋放出大量的游動孢子。
2.根據權利要求1所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于步驟(I)中所述的活化培養為25°C 30°C黑暗培養2d 4d。
3.根據權利要求2所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于所述的活化培養的溫度為27°C。
4.根據權利要求1所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于 步驟(2)中所述的水為雙蒸水； 步驟(2)中所述的貝奇野菜復合蔬果汁的體積濃度為20% ； 步驟(2)所述的復合肥優選為硫酸鉀型15-15-15復合肥，所述的復合肥溶液的質量濃度為O. 1%。
5.根據權利要求1所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于步驟(2)中所述的滅菌的條件為121°C濕熱滅菌25min。
6.根據權利要求1所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的誘導產生孢子囊的方法為取步驟(I)已活化的煙草疫霉菌邊緣菌絲塊置于無菌的培養皿上，加入步驟(2)制備的體積濃度20%的貝奇野菜復合蔬果汁液，使果汁液剛好浸過菌絲塊，27°C黑暗培養2d ;然后傾盡復合蔬果汁液，換上步驟(2)制備的質量濃度為O. 1%復合肥溶液，使復合肥溶液也剛好浸過菌絲塊，置于光照強度600LUX的白色日光燈光照培養箱中27°C連續光照培養3d，即可誘導產生孢子囊。
7.根據權利要求1所述的誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法，其特征在于 步驟(4)中所述的誘導釋放游動孢子的方法為將步驟(3)經過誘導的煙草疫霉菌4°C放置30min，然后置于27°C，30min后即可釋放出大量的游動孢子。
全文摘要
本發明屬于植物保護技術領域，公開了一種誘導煙草疫霉菌產生孢子囊并釋放游動孢子的方法。本方法包括煙草疫霉菌活化、制備產生孢子囊的誘導液、誘導產生孢子囊和誘導釋放游動孢子。本發明所用的誘導液為體積濃度15%～25%的貝奇野菜復合蔬果汁液和質量濃度0.05%～0.20%復合肥溶液，在誘導煙草疫霉產生孢子囊時于白色日光燈下連續光照培養。本發明方法簡便、快速、無污染，可用于煙草疫霉菌致病力測定，殺菌劑對煙草疫霉菌的生物活性測定以及絲瓜品種對疫病的抗病性鑒定等研究。
文檔編號C12N3/00GK103045529SQ201210593429
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者何自福, 藍國兵, 羅方芳, 佘小漫 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所