專利名稱：莖瘤芥抗逆基因及其植物表達載體和構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及莖瘤芥抗逆基因BjPERKl及其植物表達載體和構建方法及應用。
背景技術：
高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫對作物的產量及生長發育有很大影響，因此，有關植物抗逆性的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。莖瘤芥(Brassicajuncea var. tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭，是十字花科 蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。近年來對植物受體蛋白激酶(receptor protein kinase, PERK)類基因的研究表明，它們可能參與了植物細胞抗逆反應、植物形態發生、自交不親和等生理生化反應。而本實驗室(重慶郵電大學分子生物學實驗室)對莖瘤芥永安小葉品種的瘤莖膨大前后的轉錄組測序獲得了序列SEQ ID NO. 3，該序列有303bp，經NCBI的blastx比對，預測為受體蛋白激酶蛋白基因(本發明將其命名為BjPERKl)片段，而BjPERKl基因的功能是什么，是否可以增強植物抗逆性，于是本發明將通過RACE擴增獲得全長序列和植物表達載體構建與遺傳轉化，希望獲得該基因的具體功能以便能夠通過對莖瘤芥的基因工程改造獲得更好的品種。對于莖瘤芥受體蛋白激酶基因BjPERKl，目前還未見其全基因序列以及基因功能的報道，而本發明經實驗驗證，該基因蛋白具有提高植物抗逆性的作用，促進了植物在逆境條件下的適應能力和生長能力。

發明內容
鑒于此，本發明的目的之一是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl，其核苷酸序列為SEQID NO.1所示，該基因全長2252bp，通過NCBI的ORF工具檢測知其最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區有99bp，3’端非編碼區有230bp。本發明的目的之二是提供莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2所示,有640個氨基酸,且序列通過NCBI的保守結構域(conserved domains)檢測知具有蛋白激酶催化結構域。本發明的目的之三是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl，其由抗逆基因BjPERKl的最大開放閱讀框序列(編碼序列)與植物表達載體pCAMBIA1302構成。本發明的目的之四是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構建方法，包括如下步驟
(I)莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆A. BjPERKl基因5’端未知序列擴增根據序列SEQ ID NO. 3設計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ；
提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’ -Full RACE Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得5’端序列；B. BjPERKl基因3’端未知序列擴增根據序列SEQ ID NO. 3設計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T)30MN-3’ (N=A, G, C或T;M=A，G或C ；d(T) 30代表30個連續的T堿基)以及M-MLV反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得3’端序列；C. BjPERKl基因全長序列擴增將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ ID NO. 3拼接，并從5’端非翻譯區和3’端非翻譯區設計一對引物上游引物BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’下游引物BjPERKl-R :5’-AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’ ；再以步驟B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD19_T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得BjPERKl基因全長序列；(2)植物表達載體 pCAMBIA1302_BjPERKl 的構建根據BjPERKl基因的開放閱讀框序列設計一對引物，并分別引入酶切位點Bgl II和BstE II序列上游引物BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’ ；下游引物BjPERKl-Bst :5’ -GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3，；再以步驟(I)B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體得重組質粒pMD19-T-BjPERKl，轉化DH5 α感受態細胞；提取質粒pMD19-T_BjPERKl和PCAMBIA1302，并用Bgl II和BstE II雙酶切后連接，轉化，篩選并測序驗證，植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl 構建成功。本發明的目的之五是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl在提高植物耐旱特性的應用。本發明根據已知序列SEQ ID NO. 3設計巢式引物并通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥第一個受體蛋白激酶類基因BjPERKl ;通過構建莖瘤芥BjPERKl基因植物表達載體，可直接用于農桿菌介導的遺傳轉化，創制耐鹽新種質，提高植物的耐鹽抗性，可進行植物品種改良。


圖1為本發明BjPERKl基因5’端序列擴增的凝膠電泳圖；圖2為本發明BjPERKl基因3’端序列擴增的凝膠電泳圖；圖3為本發明BjPERKl基因最大開放閱讀框序列擴增的凝膠電泳圖；圖4為本發明重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構建 流程圖；圖5為本發明正常條件下野生型與轉基因型擬南芥發芽率的統計圖；圖6為本發明NaCl脅迫下野生型與轉基因型擬南芥發芽率的統計圖；圖7為本發明NaCl脅迫下野生型與轉基因型擬南芥根的長度統計圖；圖8為本發明NaCl脅迫下野生型與轉基因型擬南芥的根的攝影圖；圖9為本發明NaCl脅迫下野生型與轉基因型擬南芥的存活率統計圖。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍。本發明不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明范圍之內。實驗例1:莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆I主要試劑柱式小量植物總RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物技術有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；5’ -Full RACE Kit試劑盒、M-MLV反轉錄酶、Premix Ex Taq>DL2000DNA Marker、pMD19_T載體均購自大連寶生物工程有限公司。2實驗方法與步驟2.1BjPERKl基因5’端未知序列擴增2.1.1總RNA提取和反轉錄采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然后取約IygS RNA通過5’-Full RACE Kit試劑盒方法去磷酸化、去帽子、加接頭，最后反轉錄獲得cDNA第一鏈。2.1. 2引物設計根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO. 3設計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’2.1. 3 巢式 PCR 擴增首先為OUT擴增以步驟2.1.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物BjPERKl-AOUT和5，RACE Outer Primer (此引物為5’ -Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增，反應體系為ddH207. 4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下游引物各O. 8 μ L。PCR程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 2min，30 個循環；72°C延伸 lOmin。再做IN擴增以OUT擴增的PCR產物為模板，采用引物BjPERKl-AIN和5’ RACEInner Primer (此引物也為5’-Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增。20 μ L反應體系為ddH207. 4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下游引物各O. 8 μ L。PCR程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 90s，32 個循環；72°C延伸 lOmin。2.1. 4電泳將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖1所示，M為DL2000DNA MARKER, I為擴增條帶，可見在1200bp左右有一特異條帶。
2.1. 5TA克隆將IN擴增做3個20 μ L反應體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.1. 6測序結果測序獲得的序列的3’端序列與SEQ ID NO. 3的5’端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjPERKl基因的5’端序列。2. 2BjPERKl基因3’端未知序列擴增2. 2.1總RNA提取和反轉錄采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然后取約IygS RNA為模板，采用接頭引物5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30MN-3’ (N=A, G, C 或 T;M=A, G 或 C)(此接頭引物來自 Clontech 公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit試劑盒)以及M-MLV反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈。2. 2. 2引物設計根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO. 3設計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’ -TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’ BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’2. 2. 3 巢式 PCR 擴增首先為OUT擴增以步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物BjPERKl-SOUT和3’ RACE Primer (此引物為步驟2. 2.1中接頭引物的前部分，即5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3')做 PCR 擴增，20 μ L 反應體系為ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L,模板
Iμ L，上下游引物各 0.8 μ L。PCR 程序為94°C 3min，94°C 30s,55°C 30s,72°C 90s，30 個循環；72°C 延伸 IOmin。再做IN擴增以OUT擴增的PCR產物為模板，采用引物BjPERKl-SIN和3’ RACEPrimer 做 PCR 擴增。20 μ L 反應體系為ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L,模板 I μ L，上下游引物各 0.8 μ L。PCR 程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 70s，32 個循環；72°C延伸IOrnin02. 2. 4電泳將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖2所示，M為MarkerIII，I為擴增條帶，可見在IOOObp左右有一特異條帶。2. 2. 5TA克隆將IN擴增做3個20 μ L反應體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2. 2. 6測序結果測序獲得的序列的5’端序列與SEQ ID NO. 3的3’端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjPERKl基因的3’端序列。 2. 3BjPERKl基因全長序列擴增2. 3.1序列拼接將2.1. 6獲得的5’端序列、2. 2. 6獲得的3’端序列和已知序列SEQ ID NO. 3進行拼接，得到BjPERKl基因全長序列SEQ ID NO. 1，其全長2252bp，最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區有99bp，3’端非編碼區有230bp。為進一步驗證拼接的全長是否為真實的全長序列，于是從5’端和3’端的非編碼區設計引物進行PCR驗證。2. 3. 2引物設計根據2. 3.1的序列SEQ ID NO. 1，從兩端的非編碼區設計一對上下游引物上游引物BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’
下游引物BjPERKl-R :5’ -AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’2. 3. 3全長序列的PCR擴增以步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物 BjPERKl-F 和 BjPERKl-R 做 PCR 擴增。20 μ L 反應體系為ddH207. 4 μ L，Premix ExTaqlO μ L，模板 I μ L，上下游引物各 O. 8 μ L。PCR 程序為-MV 3min，94°C 30s,60°C 30s、72°C 2min30s，32 個循環；72°C延伸 IOmin02. 3. 4電泳將2. 3. 3擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖3所示，M為MarkerIII, I為擴增條帶,可見在2000bp左右有一特異條帶,與預期結果相符。2. 3. 5TA克隆將2. 3. 3中的擴增做3個20 μ L反應體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2. 3. 6測序結果測序獲得的序列與拼接序列的相應片段完全一致，說明成功獲得BjPERKl基因。實驗例2 :莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構建I主要試劑普通質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶Bgl II和BstE II購自大連寶生物工程有限公司；含質粒pCAMBIA1302的菌種
由本實驗室保存。2重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構建2.1引物設計根據BjPERKl基因的開放閱讀框序列設計上下游引物，并分別引入酶切位點Bgl II (AGATCT)和BstE II (GGTAACC)序列，引物為:上游引物BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3，；下游引物BjPERKl-Bst :5，-GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3，2. 2PCR擴增以實驗例I中步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，引物BjPERKl-Bgl和 BjPERKl-Bst 做 PCR 擴增:體系為 ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L，模板 I μ L，上下游引物各 O. 8 μ L0 PCR 程序為-MV 3min，94°C 30s,60°C 30s,72°C 2min，32 個循環；72°C延伸 IOmin02. 3電泳將2. 2擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖3所示，M為MarkerIII，l為擴增條帶，可見在2000bp左右有一特異條帶，與預期結果相符。2. 4TA克隆獲得重組載體pMD19-T-BjPERKl :將2. 2中的擴增做3個20 μ L反應體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19-T載體得重組載體pMD19-T-BjPERKl，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經PCR篩選，將含重組載體PMD19-T-BJPERK1的陽性DH5a菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2. 5測序結果與預期結果完全一致。2. 6重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl的構建構建方法如圖4所示，將
2.4含重組載體pMD19-T-BjPERKl的陽性DH5 a菌液擴大培養，并采用普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒pMD19-T-BjPERKl ;將實驗室保存的含有植物表達質粒PCAMBIA1302的DH5 a菌種擴大培養，并用同樣的方法提取質粒pCAMBIA1302。將提取的pMD19-T-BjPERKl質粒和pCAMBIA1302質粒分別用Bgl II酶和BstE II酶雙酶切，參照酶的說明書兩種質粒各做2個50μ L酶切體系。酶切后電泳，并切下pMD19-T-BjPERKl質粒的小片段和PCAMBIA1302質粒的大片段，利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為小片段7 μ L，大片段I μ L，T4DNA連接酶I μ L，10XT4DNA LigaseBufferl μ L)至少24小時，然后利用熱擊法轉化大腸桿菌感受態DH5a ;PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl及含該重組表達載體的大腸桿菌。2. 7pCAMBIA1302-BjPERKl重組質粒轉化農桿菌從2. 6中含PCAMBIA1302-B jPERKl載體的菌株中提取重組質粒，用液氮冷激法轉化根瘤農桿菌6￥3101，方法為@20(^ L根瘤農桿菌GV3101感受態細胞中加入2μ g (5-10μ L)重組質粒DNA,冰浴5min,然后轉至液氮中冷凍8min !②迅速與37°C水浴中溫浴5min后,力口Λ 800 μ L LB液體培養基③28°C、250rpm預培養4_5h，然后涂布于含有Kan (50mg/l)、Gent (50mg/l)的LB平板，28°C培育24-28小時后可出現菌落；④挑取菌體做菌體PCR鑒定，確定正確后保存于_70°C，即為植物遺傳轉化的工程菌株。
實施例3 :擬南芥的遺傳轉化I主要試劑植物基因組DNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。2擬南芥的培養及農桿菌侵染實驗①取野生型擬南芥種子，用75%乙醇消毒Imin后無菌水清洗；再用5%NaC10滅菌IOmin,無菌水清洗5次，去盡NaClO殘留液。加一定量無菌水，于4°C條件下春化3_4天；②將春化3-4天的擬南芥種子在MS空白培養基上光照培養7天，待長出幼苗，移栽至蛭石培養基(蛭石營養土 珍珠巖=3:1:1)，1/2MS液體培養基澆灌；③待植物培養至初生花序10-15cm，次生花序剛剛形成花芽狀時，去除初生花序；培養至可進行侵染實驗；④將實驗例2步驟2. 7中制備好的已轉化pCAMBIA1302-BjPERKl質粒的農桿菌菌液擴大培養，即在轉化前I天晚上轉入大瓶過夜培養；至菌液濃度為0D600=2. O ;離心，棄上清，將農桿菌沉淀懸浮于約3倍體積的滲透培養液中，使0D600在O. 8左右；⑤將植物的地上部分浸入農桿菌懸浮液中侵染5分鐘；用保鮮膜將侵染過的植物(T0代植物)罩起來以保持濕度，置培養箱中黑暗培養12小時后正常條件培養；2-3天揭去保鮮膜，7天后可澆水；并定期侵染幾次；⑥繼續培養至植物成熟，收種子(Tl代)。MS培養基由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素等按一定比例組成。MS培養基作為目前使用最廣的離體細胞培養基，由于其中無機鹽濃度較高，為外植體的生長提供了足夠的礦質營養并能使愈傷組織加速生長。為便于溶液配制及減小誤差，先按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質配制一定體積的母液。待用時再按一定比例稀釋混合。3擬南芥轉基因純合體的篩選Tl代種子經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培養基上，至人工氣候培養箱中培養，觀察幼苗的生長狀況。10-12天后明顯可以觀察到非轉基因擬南芥只能長出2片子葉、沒有真葉、根非常短，而轉基因擬南芥長出2-4片真葉、根長，于是將轉基因苗10株移栽至蛭石培養基中，存活2株且成熟后分別收取種子(T2代)并命名為T2-1和T2-2種子。期間用基因組提取試劑盒提取2株植物葉片的基因組DNA，以基因組DNA為模板，做PCR檢測驗證是否為轉基因擬南芥，反應體系為20 μ1:體系為ddH207. 4μ L，Premix Ex TaqlOy L，模板 I μ L，上下游引物(BjPERKl-Bgl ^PBjPERKl-Bst)各 O. 8μ L。PCR 程序為94 °C 4min，94°C 40s,60 °C 40s,72 °C 2min，32 個循環；72°C 延伸IOmin。PCR結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性。將T2-1和T2-2種子按Tl代種子方法分別播種，觀察幼苗生長狀況，轉基因與非轉基因比例均為3:1，然后將轉基因植株移栽蛭石中并當種子成熟后分別收集每一株的種子(T3代種子)，隨機挑選10株的T3代種子并各取部分種子按Tl代種子方法進行播種，其中有2株的T3代種子全部生長為轉基因植株，由此判斷此2株的T3代種子為純合體，將這2株的T3代種子保存，并分別命名為Τ3-1、Τ3-2，它們將用于后續的抗逆性實驗。實施例4 :純合體擬南芥的抗鹽性實驗I鹽脅迫下BjPERKl基因對擬南芥發芽率的影響
1.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉基因型種子T3-1、T3-2經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含O和IOOmM NaCl的MS培養基上，觀察野生型和轉基因型種子在不含和含NaCl的條件下的生長狀況。1. 2結果如圖5所示，在不含NaCl的MS培養基上，野生型和轉基因型種子的發芽率無明顯差別，播種后第一天發芽率均在50%左右，第二天則全部發芽；而在含IOOmM NaCl的MS培養基上，野生型則不如轉基因型種子發芽率高，如圖6所示，播種后I天，野生型種子無發芽，轉基因型均有部分發芽，播種后第2-4天野生型發芽率不如轉基因型。由此說明BjPERKl基因有助于提高植物在鹽脅迫下的發芽率，即提高了植物的抗逆性。2鹽脅迫下BjPERKl基因對擬南芥根的生長的影響2.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉基因型種子T3-1、T3-2經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含0、100mM、150mM的NaCl的MS培養基上生長10天后觀察野生型和轉基因型擬南芥根的生長狀態。2. 2結果如圖7所示，在不含NaCl的MS培養基上，野生型和轉基因型擬南芥的根的生長無明顯差別，均在6. 5cm左右；在含NaCl的MS培養基上，根的生長均受到抑制，且NaCl的濃度越高抑制越強，但明顯地，野生型擬南芥的根比轉基因型的短。圖8所示為野生型和轉基因型擬南芥的根的照片，明顯可以看到在鹽脅迫下，野生型擬南芥的根比轉基因型短。根短直接影響植物的營養吸收，從而影響植物的生長狀況，由此說明BjPERKl基因的超表達有助于植物在高鹽下根的生長，即提高了植物的抗逆性。3鹽脅迫下BjPERKl基因對擬南芥的存活率的影響3.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉基因型種子T3-1、T3-2經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含300mM的NaCl的MS培養基上生長2周后移栽至無鹽脅迫的蛭石中繼續培養使恢復生長，12天后觀察仍然存活的植株數量(植株全部白化被認為死亡)。3. 2結果如圖9所示，高鹽脅迫生長2周后于正常狀態下培養12天后，野生型植株死亡率高，存活率不到5%，而轉基因型的存活率達到35%以上，具有顯著性差異。說明BjPERKl基因的超表達有助于植物在高鹽下的生長，即提高了植物的抗逆性。綜上所述，B jPERKl基因具有提高植物抗逆性的作用，促進植物在逆境下的適應能力和生長能力。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本 發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO.1所示，全長序列2252bp，最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區有99bp，3’端非編碼區有230bp。
2.莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其特征在于其氨基酸序列為SEQID NO. 2所示。
3.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl，其特征在于由權利要求1所述的抗逆基因BjPERKl的最大開放閱讀框序列與植物表達載體PCAMBIA1302 構成。
4.權利要求3所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構建方法，其特征在于包括如下步驟 (1)莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆 A.BjPERKl基因5’端未知序列擴增 根據序列SEQ ID NO. 3設計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’ -AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ； 提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’ -Full RACE Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得5’端序列； B.BjPERKl基因3’端未知序列擴增 根據序列SEQ ID NO. 3設計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’ 提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物和反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到PMD19-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得3’端序列； C.BjPERKl基因全長序列擴增 將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ ID NO. 3拼接，并從5’端非翻譯區和3’端非翻譯區設計一對引物上游引物 BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’下游引物 BjPERKl-R :5’ -AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’ ； 再以步驟B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5 α感受態細胞，篩選并測序獲得BjPERKl基因全長序列； (2)植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl的構建 根據BjPERKl基因的最大開放閱讀框序列設計一對引物，并分別引入酶切位點Bgl II和BstE II序列上游引物 BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’ ；下游引物 BjPERKl-Bst :5’ -GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3’ ； 再以步驟(I) B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD 19-T載體得重組質粒pMD19-T-BjPERKl，轉化DH5a感受態細胞；提取質粒pMD19-T_BjPERKl和PCAMBIA1302，并用Bgl II和BstE II雙酶切后連接，轉化，篩選并測序驗證，植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl 構建成功。
5.如權利要求4所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構建方法，其特征在于，所述接頭引物的序列為5’ -ATTCTAGAGGCC GAGGCGGCCGACATG-d ⑴ 30MN-3'，其中 N=A, G, C 或 T，M=A, G 或 C ;所述反轉錄酶為 M-MLV 酶。
6.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl在提高植物耐鹽特性的應用。
全文摘要
本發明公開了莖瘤芥受體蛋白激酶類基因BjPERK1的核酸序列和氨基酸序列，以及植物表達載體和構建方法。本發明所構建的植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1是由BjPERK1基因插入到pMD19-T，經Bgl II和BstEII雙酶切后連接到pCAMBIA1302的Bgl II和BstE II位點而得到的重組質粒。該植物表達載體用于植物遺傳轉化，BjPERK1基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成BjPERK1蛋白，從而提高植物耐鹽性。
文檔編號C12N15/66GK103014035SQ20121059229
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者向瀏欣, 蔡應繁, 付于銀, 劉吉軍, 冉燕子, 王秋娟, 王小艷 申請人:重慶郵電大學