專利名稱：一種實時定量pcr測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及試劑盒，特別涉及ー種實時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒。
背景技術：
端粒(Telomere)是一段DNA重復序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實端粒的長度可以隨著細胞分裂次數的增多而逐漸變短。這ー發現在端粒和細胞衰老之間建立了緊密的聯系。端粒重復序列的長度可能起著ー種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細胞可在體外傳代培養80—90代，來自70歲老人的體細胞在體外只能傳代培養20 30代，而且端粒的重復序列長度也縮短很多。
·[0003]端粒酶(Telomerase)是細胞中負責端粒延長的ー種酶,是基本的核蛋白逆轉錄酶，可將端粒DNA加至真核細胞染色體末端。端粒在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細胞復制能力受限)，從而增強體外細胞的増殖能力。但是，在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到相當嚴密的調控。實驗證明，體細胞里沒有端粒酶的活性，所以體細胞每分裂一次，端粒也就縮短ー些。隨著細胞不斷地進行分裂，端粒的長度將越來越短，當達到ー個臨界長度吋，細胞染色體會失去穩定性，使細胞不能再進行分裂而進入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復序列的長度來推測細胞有絲分裂的次數，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩定性,細胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發生密切相關。在人體內的各種細胞中，生殖細胞和干細胞染色體的末端比體細胞染色體的末端長出幾千個堿基對，并且在這兩類細胞里能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細胞里都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源于體細胞的惡性腫瘤細胞卻又重新出現了端粒酶活性，發揮其合成端粒重復序列的功能，以補償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復序列不會達到導致細胞死亡的臨界長度，從而獲得細胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細胞在體內或體外都能無限制地分裂増殖。上文提到的端粒長度縮短指的是所有染色體末端端粒的平均長度。近年來，很多實驗觀察開始質疑端粒的平均長度與衰老之間的聯系。ー些研究小組提出了于端粒相關的細胞衰老是由単一或某幾個短端粒引起的觀點。這ー觀點的正確性也被越來越多的實驗數據所證明。目前，研究端粒長度主要是應用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。另外,有ー些手段可以比較精確的研究染色體中短端粒的情況，例如基于突光原位雜交(Q-FISH)的技術,或者 STELA (single telomere length analysis)技術等。
實用新型內容實用新型目的本專利涉及一種實時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值試劑盒。[0009]ー種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設有容器空腔分別放置PCR反應液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84-mer ;其中所；tdi的36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC 3’I ；36B4 Reverse的核苷酸序列為5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’ ；Telomere Forward 的核苷酸序列為5，CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT 3，；TeIomereReverse 的核苷酸序列為5’ GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT3’ ;84-mer的核苷酸序列為(TTAGGG) 14的核苷酸序列為含14個TTAGGG重復序列的核苷酸片段；36B4片段的核苷酸序列為5’ CAG CM GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAGACA AGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。所述的PCR反應液含有PCR緩沖液、I X SYBR Green master mix，dNTPS。引物的濃度為100nM，84-mer和36B4片段的濃度為lug/uL; ー種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒的應用，其特征在于按步驟實現A.從人外周血細胞中獲取基因組DNA ;B.使用權利要求I所述的試劑盒繪制標準曲線，用來計算RT-qPCR反應中樣品端粒的總長度和反應中染色體的總拷貝數標準曲線I使用濃度梯度為LIO'IO'IO'10_4，10_5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸的RT-qPCR反應的Ct值繪制；標準曲線2使用人工合成的75 bp 36B4片段RT-qPCR反應的CT值繪制，其濃度梯度為LIO'IO'IO-3，10' 1(T5,1(T6 ；C.使用RT-qPCR擴增步驟A中獲得的樣品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，獲得相應的Ct值，井根據標準曲線計算樣品中端粒的總長度和樣品中36B4基因的拷貝數。D.計算樣品中端粒平均長度絕對值端粒平均長度=端粒總長度/ 36B4拷貝數；其中PCR反應條件為95°C變性 10 min，然后 95°C 15sec，60°C I min，共 40 個循環。具體來說I.引物設計本專利涉及的PCR引物除了常規的用于擴增端粒片段的引物對，還包括一段84 bp的寡核苷酸片段(84-mer)和一段75 bp的36B4片段。2.繪制標準曲線a)將 84-mer 梯度稀釋1，10' 1(T2，1(T3，10' 1(T5，10'84-mer寡核苷酸鏈總長度計算方法如下(假設姆個反應需未稀釋84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知 84-mer 的分子量為 26667. 2)lmol=6. 02 X IO23 個微粒數平均ー個84-mer 的質量為2. 6667 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 44 X l(T19g ;每個PCR反應體系中未稀釋84-mer總量為60 X 10べ2 / (0. 44 X 1(T19 )= I. 36X IO9 個；由于84-mer的長度為84bp，因此每個PCR反應體系中未稀釋84-mer總長度為I. 36 X IO9 X 84 = I. 18 X IO5 kb ；[0026]同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個反應體系中的總長度，繪制標準曲線I。b)繪制75 bp的36B4片段拷貝數標準曲線將75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，10' 1(T2，10' 1(T4，1(T5，I(T6 ；36B4片斷為75 bp,相對分子量為23268. 1，單個36B4 75 bp片段質量為2. 32681 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 38 X 10_19 g ；假設反應體系中最高濃度75 bp的36B4含量為200 pg，那么每個反應體系中75bp 36B4的拷貝數為200 X 1(T12 / 0. 38 X 1(T19 = 5. 26X IO9 ;相當于在二倍體的染色體組中含有5. 26 X 109/2=2. 63 X IO9個36B4基因拷貝。同理可得不同稀釋濃度反應體系中75 bp 36B4拷貝數，作標準曲線2。3. RT-qPCR擴增gDNA樣品中端粒和36B4基因； 4. RT-QPCR擴增gDNA樣品中端粒和36B4基因(內參)，并通過兩個標準曲線計算gDNA樣品中端粒的總長度及樣品中gDNA總拷貝數，即可以計算端粒平均長度端粒平均長度=樣品中端粒總長度/ gDNA總拷貝數。原理說明I、實時熒光定量PCR (RT-qPCR)原理無論是對遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進行基因診斷，還是研究藥物對基因表達水平的影響，或者監控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術都可以發揮很大作用。定量PCR技術的最新進展是實時熒光定量。該技術借助于熒光信號來檢測PCR產物，一方面提高了靈敏度，另ー方面還可以做到PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據CT值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。根據最終得到的數據不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數或濃度。CT值的定義是擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環數。定量PCR的數學原理理想的PCR反應X=X0 X 2n非理想的PCR反應X=X0 (1+Et) n ；n:擴增反應的循環次數X :第n次循環后的產物量X0 :初始模板量Ex :擴增效率在擴增產物達到閾值線時Xct=X0 (I+Ex)CT,(I)其中Xct :為熒光擴增信號達到閾值強度時所擴增產物的量，在閾值線設定以后，它為常數，設定為M ;方程式(I)兩邊同時取對數得IogM=IogX0 (I+Ex)CT(2)[0052]整理方程式(2)得IogX0=-Iog (1+Ex) *CT+logM(3)IogX0與CT呈線性關系，根據樣品擴增的CT值可以計算出樣品中的所含的模板量。2,SYBR Green I熒光染料技術原理SYBR Green I是ー種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合吋，發出熒光JAdna雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在ー個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是I、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性吋，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈 增量加大。2、RT-qPCR測量端粒長度原理如圖5所示，緑色區域為端粒區，即(TTAGGG) n重復序列；藍色箭頭為與端粒特異性結合的引物。由干與端粒結合的引物數量跟端粒的長度呈正相關，端粒長，其可結合的引物數量多，熒光強度大，可以理解為拷貝數多；反之則拷貝數少，熒光強度弱。所以使用RT-qPCR法，得到各個樣品的CT值，即可間接反映每個樣品中端粒的平均長度。有益效果端粒的縮短被認為與細胞的衰老和癌癥等疾病的發生密切相關。同時，細胞內每條染色體兩端的端粒并不是以相同的速度縮短，有的端粒因為某些原因會突然大幅度變短，形成相對短的端粒。當這些短端粒達到或超過某ー極限，就會導致細胞的衰來死亡，或者如癌癥等的疾病。因此，準確地檢測細胞端粒長度，對預防衰老和預防癌癥的發生都能起到非常大的幫助。本發明采用試劑盒可以方便，快捷測定端粒的平均長度的絕對值，使用エ業生產或檢測。


圖I.標準曲線1，用于計算每個RT-qPCR反應中端粒的總長度，橫軸為端粒長度，單位為Kb，PCR反應的Ct值與端粒長度在圖I所示的范圍內呈線性關系。通過優化樣品的濃度，使其PCR反應的CT值落在標準曲線線性范圍內，應此使用此標準曲線計算所得數值等于端粒在每個PCR反應中的總長度。圖2.標準曲線2，用于計算36B4在每個反應中的拷貝數，間接計算每個反應中染色體的拷貝數，即每個PCR反應中端粒的總拷貝數。橫軸為36B4的拷貝數，PCR反應的CT值與36B4拷貝數的LOG值在途中所示范圍內呈線性關系。圖3.使用RT-qPCR法和TRF法測得的端粒平均長度絕對值的相關性。圖4為本發明的示意圖，其中盒體1，襯墊2，PCR反應液3，Taq酶4，136B4Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Revers e 9,84-mer 10,36B4片段I。圖5. RT-qPCR法檢測端粒長度的示意圖,其中有圓圈的區域為藍色,無圓圈區域為綠色。
具體實施方式
[0066]RT-QPCR使用PCR反應液購自Qiagen，所有引物或核苷酸片段為生工合成。實施例I外周血基因組DNA (gDNA)的提取I).血液樣品分裝成I mL/管，干-70で儲存。2).將樣品解凍，每管樣品加入0. 8 mL檸檬酸緩沖液，混勻后12000轉離心Imin,去上清。3).加入I mL IX檸檬酸緩沖液，震蕩后12000轉離心I min，去上清。4).カロ 入 375 uL 0. 2M 的 Na2OAc,震蕩后加入 25 uL 10% 的 SDS 和 5 uLproteinase K (20 mg/mL H2O),震蕩混勻后 55 度孵育 I h。5).加入 120 uL 酚 / 氯仿 / 異戊醇(v/v :25/24/1),震蕩 30 sec 后于 12000 轉離心2 min。 6).將水相層移至新的I. 5 mL離心管仲，加入I mL，冷的100%こ醇，混勻并于-20度孵育15 min。7). 12000轉離心2 min，去上清并烘干。8).加入180 uL 10 1的TE緩沖液，震蕩后于55で孵育10 min。9).加入20 uL，2M的醋酸鈉溶液，混勻后加入500 uL，冷的100%こ醇，混勻后于12000轉離心I min,去上清。10).用I mL，80%的こ醇洗滌沉淀，之后于12000轉離心I min，去上清。11).真空干燥沉淀10 min。12).將沉淀重新溶解于200 uL TE緩沖液中，55 °C孵育過夜，獲得gDNA。實施例2 RT-QPCR法測端粒平均長度的絕對值I、ー種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，包括盒體1，襯墊2，PCR反應液3,Taq酶4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, TelomereRevers e 9,84-mer 10，36B4片段11，襯墊2上設有容器空腔分別放置PCR反應液3，Taq酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Reverse 8,84-mer 10，36B4 片段 11 ；其中所述的36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AATCC 3，；36B4 Reverse 的核苷酸序列為5，CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3，；Telomere Forward 的核苷酸序列為5’ CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTTTGG GTT TGG GTT 3’ ；Telomere Reverse 的核苷酸序列為5’ GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCTTAC CCT TAC CCT 3’ ；84-mer的核苷酸序列為(TTAGGG) 14的核苷酸序列為含14個TTAGGG重復序列的核苷酸片段；36B4 片段的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT MT CCG TCT CCA CAGACA AGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。2、利用84-mer繪制總長度標準曲線I) ,84-mer的RT-qPCR反應條件RT-qPCR反應體系為20 uL，以84-mer為模板，取84-mer I uL,100 nM 引物 Telomere Forward I uL,100 nM引物Telomere ReverseluL,余量為 PCR 反應液。RT-qPCR 反應條件95 °C 10 min, 40 個循環(95°C 15 sec, 60 °C Imin ノ2)、繪制標準曲線A)將 84-mer 梯度稀釋1,10べ，1(T2，10' 1(T4，1(T5，10'84-mer寡核苷酸鏈總長度計算方法如下假設姆個反應需未稀釋84-mer 60pg,即60 X 1(T12 g,已知84-mer的相對分子量為 26667. 2 ；平均ー個84-mer 的質量為2. 6667 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0. 44 X 1(T19 ;每個PCR反應體系中未稀釋84-mer總量為60 X 10べ2 / 0. 44 X 10ィ9 = I. 36 X 109，因此每個PCR反應體系中未稀釋84-mer總長度為1.36 X IO9X 84= I. 18 X105kb ；同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個反應體系中的總長度，繪制標準曲線1(圖1)，標準曲線方程為log (TL) =-4. 86Ct+40. 14，其中TL為總長度。3、利用36B4繪制標準曲線I) 36B4 75 bp 的 RT-qPCR 反應條件RT_qPCR 反應體系為 20 uL，以 36B4 為模板，取 36B4 IuL , 100 nM 36B4 Forward IuL, 100 nM 36B4 Reverse luL，余量為 PCR 反應液。RT-qPCR 反應條件95 °C 10 min, 40 個循環(95°C 15 sec, 60 °C I min)將75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，10' 1(T2，10' 1(T4，1(T5，I(T6 ；36B4 為 75 bp，相對分子量為 23268. I ；平均ー個36B4 75 bp 質量為 2. 32681 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0 . 38 X 1(T19 g ；假設反應體系中最高濃度75 bp 36B4含量為200 pg，那么每個反應體系中75 bp36B4 的拷貝數為:200 X 10べ2 / 0. 38 X 10ィ9 /2= 2. 63 X IO9 ；同理可得不同稀釋濃度反應體系中75 bp 36B4拷貝數，作標準曲線2 (圖2)。標準曲線方程為log (TC)=-5. 11Ct+39. 57 ，其中TC為36B4基因的拷貝數。因為36B4基因是單拷貝基因，是做RT-qPCR常用的內參基因之一，所以知道了 gDNA中36B4的拷貝數就等于知道了樣品中染色體的拷貝數，才可以計算端粒平均長度的絕對值。4、RT-qPCR擴增gDNA樣品中端粒和75 bp的36B4 (內參)實施例I所獲得gDNA樣品中端粒的RT-qPCR反應條件RT_qPCR反應體系為20uL, gDNA I uL,100 nM Telomere Forward I uL,100 nM Telomere Reverse I uL US里的引物跟84mer的引物是ー樣的)，余量為PCR反應液；PCR反應條件為95°C 10 min, 40個循環(95で 15 sec, 600C I min)。步驟gDNA樣品中75 bp的36B4的RT-qPCR反應條件RT_qPCR反應體系為20uL，其中 36B4 I uL，100 nM 引物 36B4 Forward I uL，100 nM 引物 36B4 Reverse IuL，余量為 PCR 反應液。RT-qPCR 反應條件95 °C 10 min, 40 個循環(95°C 15 sec, 60 °C Imin ノ。將步驟(4)獲得的gDNA樣品中端粒和36B4的Ct值，分別代入兩個標準曲線方程，即 log (TL) = (CT (telomere)-40. 14) / -4. 86，其中 TL 為樣品中端粒總長度；L0G (TC) = (CT(36b4)-39. 57) / -5. 11，其中TC為樣品中端粒拷貝數，即可以計算端粒平均長度=端粒總長度/端粒拷貝數。[0109]因為84mer是(TTAGGG)14，相當于人工合成的端粒重復序列，與細胞中的端粒序列并無區別，所以用人工合成的端粒序列做標準曲線是可以用于計算樣品中真正的端粒的長度的；同理人工合成的36B4片段也可用于計算樣品中的36B4拷貝數。另外，計算平均長度的公式只是ー個簡單的數學計算，比如一輛汽車行駛的日平均里程=總的行駛里程/天數，這樣的公式是不用詳細推導的，同理，樣品中端粒的平均長度、端粒的總長度和端粒的拷貝數(即染色體拷貝數)之間的關系也是顯而易見的，無需推導。對比例TRF法測端粒的平均長度(參考Aubert等，Telomere lengthmeasurement—しaveats ana a critical assessment of tne available technologiesand tools. Mutat Res. 2012 Feb I; 730 (1-2) : 59-67.)I).將0.5 ug gDNA樣品用Hae III (購自NEB)酶完全消化；2).消化后的gDNA片段由瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉移至尼龍膜上； 3).使用放射性32P標記的探針32P- (TTAGGG) 7與尼龍膜上的端粒片段雜交；4).通過放射自顯影檢測各個樣品端粒片段的長度。將TRF法測得的端粒長度取對數，然后將其與RT-qPCR法測得的樣品端粒平均長度絕對值做圖，可得如圖3所示，各數據點的趨勢線為一條直線，顯示本專利涉及的RT-qPCR法所測得的端粒平均長度絕對值與經典的TRF法所測得的結果有很強的相關性，是可信賴的結果。
權利要求1.一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReVerseA^menSeBA片段，襯墊上設有容器空腔分別放置PCR反應液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse，84_mer0
專利摘要本實用新型涉及試劑盒，特別涉及一種實時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒。一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR反應液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設有容器空腔分別放置PCR反應液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer。本實用新型采用試劑盒可以方便，快捷測定端粒的平均長度的絕對值，使用工業生產或檢測。
文檔編號C12Q1/68GK202558870SQ20122023865
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者葉汝章, 張娟, 全利, 郝小江, 朱兆云, 滕凌, 葉亞東, 朱文華, 潘鸝, 胡娟, 路易斯伊格納羅 申請人:云南路易斯中藥現代化工程技術研究中心