專利名稱：一種ska1基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種SKA1基因檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種SKAl基因檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
SKAl (The spindle and kinetochore associated complex subunit I)基因定位于染色體18q21.1，編碼含有255個氨基酸、分子量約為30kDa的蛋白。目前對SKAl 蛋白結(jié)構(gòu)的研究還不深入，只明確了其在N端具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Rual JF, Venkatesan K，Hao T，et al.Towards a proteome—scale map of thehuman protein-protein interaction network. Nature 2005;437:1173-1178·)。最初質(zhì)譜分析結(jié)果表明，SKAl 蛋白被確定為紡錘體的組成部分(Cheeseman IMj Brew Cj Wolyniak Mj et al.1mplication of a novel multiprotein Damlp complexin outer kinetochore function. J Cell Biol. 2001;155:1137-1145.)。后來通過酵母雙雜試驗，發(fā)現(xiàn)了紡錘體著絲點復(fù)合物(The spindle and kinetochoreassociated complex, SKA)的另一個亞基 SKA2，體外和體內(nèi)研究結(jié)果均表明，SKAl和SKA2相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體，對于SKA2的穩(wěn)定以及SKA蛋白在著絲點和微管中的定位是必須的(Hanisch A.，Sillje HHW, Nigg EA. Timely anaphase onset requires a novel spindle and kinetochore complexcomprising Skaland Ska2. EMBO J. 2006;25:5504-5515. )。SKA復(fù)合體對于有絲分裂至關(guān)重要，可以使所有染色體的著絲點都排列在赤道板平面上，這對于確保染色體均等分配和維持基因組穩(wěn)定性十分必要。 有絲分裂后期，染色體在紡錘體著絲點微管的作用下移向兩極，并導(dǎo)致紡錘體檢查點沉默， 在這個過程中SKAl復(fù)合體也是必須的蛋白。然而在當(dāng)時的研究中，SKAl在染色體分離中的作用并沒有闡述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J雜志上的報道闡述了 SKAl復(fù)合體在著絲點和微管界面上發(fā)揮功能，并與微管直接作用，在微管上形成低聚裝配體，沿著微管以一種解聚-偶聯(lián)的方式運動，參與有絲分裂期間染色體的運動(Welburn JPIj Grishchuk ELj Backer CBj et al. The human kinetochore Ska lcomplex facilitates microtubuled epolymerization-coupled motility. Dev Cell 2009;16:374-385·)。[0003]基因組研究表明，SKAl基因所處的18q21.1與慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生有關(guān)(Crowther-Swanepoel D，Broderick P，Di Bernardo MCj et al. Common variants at 2q37. 3，8q24. 21，15q21. 3and 16q24.1influence chroniclymphocytic leukemia risk. Nature genetics 2010;42:132-136.)。這意味著SKAl可能通過調(diào)節(jié)有絲分裂過程、細(xì)胞周期進(jìn)展的方式參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。另外，在最初解析SKAl功能的研究中，以微管解聚藥物噻氨酯ii_(nocodazole)和秋水仙堿(colchicine)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SKAl在著絲點中的積聚水平降低；對阻滯于有絲分裂期間的細(xì)胞，加nocodazole處理，可導(dǎo)致SKAl和微管先后從著絲點上脫離；相反地，當(dāng)細(xì)胞免除了 nocodazole的處理時，SKAl蛋白在著絲點上的定位得以恢復(fù)，相應(yīng)的，紡錘體重新形成。而微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol)，并沒有影響 SKAl 在著絲點上的定位(SauerG，Korner R，Hanisch A, et al. Proteome analysis of the human mitotic spindle. Mol Cell Proteomics 2005; 4:35-43.)。這些研究都提不了 SKAl可能影響某些抗腫瘤藥物敏感性。因此，了解SKAl基因在腫瘤中的表達(dá)情況，具有很強(qiáng)的臨床實用價值。實用新型內(nèi)容[0004]本實用新型所要解決的技術(shù)問題就是針對目前對SKAl基因表達(dá)檢測特異性不強(qiáng)，檢測成本較高而且方法較復(fù)雜的不足之處，提供了一種特異性高，使用簡便的SKAl基因檢測試劑盒。[0005]本實用新型解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案之一為一種SKAl基因檢測試劑盒，其包括盒體，襯墊，PCR緩沖液，Taq酶，內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品，SKAl基因檢測引物，內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物，陰性對照，陽性對照和裝有去離子水的試管。所述的襯墊設(shè)置于盒體內(nèi)，襯墊上設(shè)有容器孔，所述的裝有PCR緩沖液的試管，裝有Taq酶的試管，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管，裝有 SKAl基因檢測引物的試管，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管，陰性對照管，陽性對照管和裝有去離子水的試管放置于容器孔內(nèi)。[0006]其中所述襯墊上的容器孔較佳的為8個，所述的容器孔在襯墊上較佳地為分成兩排平行排列。其中所述PCR緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR緩沖液。所述PCR緩沖液較佳地包括dNTPs，MgCl2和熒光染料SYBR Green。其中所述dNTPs為常規(guī)dNTPs。所述MgCl2為本領(lǐng)域常規(guī)MgCl2，其濃度較佳地為4 6mM。[0007]其中所述SKAl基因檢測引物優(yōu)選地為[0008]SKAl 基因 5’ 檢 測引物，其序列為5’ -TGATGTGCCAGGAAGGTGAC-3’ ；[0009]SKAl基因3’檢測引物，其序列為[0010]5，-CAAAGGATACAGATGAACAACAGC-3，。[0011]其中所述內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物為[0012]GAPDH 基因 5’ 引物，其序列為5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ；[0013]GAPDH 基因 3’ 引物，其序列為5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。[0014]其中所述Taq酶為本領(lǐng)域常規(guī)Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶較佳地包括目前商品化的各種Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶的生產(chǎn)廠商較佳地包括TAKARA， New England biolabs, Invitrogen 或Promega。[0015]其中所述內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)選GAPDH基因。[0016]其中所述陰性對照為本領(lǐng)域常規(guī)的陰性對照，本實用新型優(yōu)選為無SKAl基因表達(dá)的cDNA樣本。其中所述陽性對照為本領(lǐng)域常規(guī)的陽性對照，本實用新型優(yōu)選為有SKAl 基因表達(dá)的cDNA樣本。其中所述去離子水為本領(lǐng)域常規(guī)去離子水。[0017]本實用新型所述SKAl基因 檢測試劑盒可以高效檢測SKAl基因的表達(dá)情況。所述檢測較佳地在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，所述熒光定量PCR儀較佳地包括各種商品化的熒光定量PCR儀。所述突光定量PCR儀廠商較佳地為Applied Biosystems公司或Bio-rad公司。[0018]本實用新型所述SKAl基因檢測試劑盒的保藏條件較佳地為_4°C，盡量減少反復(fù)凍融。[0019]本實用新型所述SKAl基因檢測試劑盒的較佳應(yīng)用實例為[0020]首先通過提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。[0021]其次，用無菌去離子水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為IX IO8 IX IO12拷貝/ml。[0022]第三步，配制熒光定量PCR反應(yīng)液1μ I檢測樣品，樣品分別為第一步所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，標(biāo)準(zhǔn)品(GAPDH基因)，陰性對照(不含SKAl基因的cDNA樣本)和陽性對照(含有SKAl基因的cDNA樣本)，5μ I PCR5X緩沖液，I μ I SKAl基因檢測引物，I μ I內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物，O. 5μ I Taq DNA聚合酶和16. 5 μ I去離子水。反應(yīng)液總體積為25 μ 1，在熒光定量 PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。[0023]qPCR反應(yīng)程序優(yōu)選地為[0024](I) 95O I 分鐘，[0025](2)95°C5 秒，[0026](3)60°C 20秒，讀板，其中步驟(2) (3)重復(fù)40個循環(huán)；[0027](4) 65°C 95°C，每循環(huán)提高O. 5°C，維持5秒后讀板，繪制熔解曲線。[0028]根據(jù)熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物，確定無非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算樣本中SKAl基因和GAPDH的表達(dá)量(拷貝/μ 1)，SKAl基因與GAPDH表達(dá)量的比值即為 SKAl基因的表達(dá)指數(shù)。[0029]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本實用新型較佳實例。[0030]本實用新型所用試劑和原料均市售可得。[0031]本實用新型的積極進(jìn)步效果在于本實用新型提供的SKAl基因檢測試劑盒，通過優(yōu)化設(shè)計SKAl基因的引物和PCR條件，克服了普通熒光定量PCR檢測步驟復(fù)雜，假陽性率高的缺陷，不僅保證了熒光定量PCR反應(yīng)的高靈敏性，而且使被檢測基因的特異性大大提高。本實用新型提供的SKAl基因檢測試劑盒設(shè)計合理，無需設(shè)計針對SKAl基因的熒光探針，檢測操作方便而且節(jié)約成本。


[0032]圖1為SKAl基因檢測試劑盒結(jié)構(gòu)不意圖。[0033]圖2 (A)為陰性對照的SKAl基因擴(kuò)增曲線，其中a為陰性對照重復(fù)l，b為陰性對照重復(fù)2，c為陰性對照重復(fù)3。圖2 (B)為陰性對照的SKAl基因熔解曲線，其中a為陰性對照重復(fù)1，b為陰性對照重復(fù)2，c為陰性對照重復(fù)3。[0034]圖3 (A)為陽性對照的SKAl基因擴(kuò)增曲線，其中d為陽性對照重復(fù)l，e為陽性對照重復(fù)2，f為陽性對照重復(fù)3。圖3 (B)為陽性對照SKAl基因熔解曲線，其中d為陽性對照重復(fù)1，e為陽性對照重復(fù)2，f為陽性對照重復(fù)3。[0035]圖4 (A)為檢測樣本 的SKAl基因擴(kuò)增曲線，其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)I, i為檢測樣本重復(fù)2，h為檢測樣本重復(fù)3。圖4 (B)為檢測樣本SKAl基因熔解曲線，其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)1，i為檢測樣本重復(fù)2，h為檢測樣本重復(fù)3。[0036]圖5 (A)為陰性對照GAPDH基因擴(kuò)增曲線，其中a為陰性對照重復(fù)1，b為陰性對照重復(fù)2，c為陰性對照重復(fù)3。圖5 (B)為陽性對照GAPDH基因擴(kuò)增曲線，其中d為陽性對照重復(fù)l，e為陽性對照重復(fù)2，f為陽性對照重復(fù)3。圖5 (C)為檢測樣本GAPDH基因擴(kuò)增曲線，其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)1，h為檢測樣本重復(fù)2，i為檢測樣本重復(fù)3。[0037]圖6 (A)為陰性對照GAPDH基因熔解曲線，其中a為陰性對照重復(fù)1，b為陰性對照重復(fù)2，c為陰性對照重復(fù)3。圖6 (B)為陽性對照GAPDH基因熔解曲線，其中d為陽性對照重復(fù)l，e為陽性對照重復(fù)2，f為陽性對照重復(fù)3。圖6 (C)為檢測樣本GAPDH基因熔解曲線，其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)l，h為檢測樣本重復(fù)2，i為檢測樣本重復(fù)3。
具體實施方式
[0038]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本實用新型，但并不因此將本實用新型限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件， 或按照商品說明書選擇。所述的室溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫溫度，較佳地為20 40°C。[0039]逆轉(zhuǎn)錄試劑盒=TAKARA大連，商品編號D6110A，[0040]7500型定量PCR儀美國ABI公司，[0041]Trizol 試劑，DEPC 水美國 Invitrogen 公司，[0042]異丙醇，乙醇，氯仿試劑上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，[0043]SYBR Green 突光染料美國 Ivitrogen 公司。[0044]實施例1 SKAl基因檢測試劑盒[0045]結(jié)合圖1，本實用新型SKAl基因檢測試劑盒包括盒體1，襯墊2，裝有PCR緩沖液的試管3，裝有Taq酶的試管4，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管5，裝有SKAl基因檢測引物的試管 6，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管7，陰性對照管8，陽性對照管9和裝有去離子水的試管10。[0046]其中襯墊2設(shè)置于盒體I內(nèi)，襯墊2上設(shè)有8個容器孔，所述的容器孔在襯墊2上分成兩排平行排列。每個容器孔內(nèi)分別放置上述裝有PCR緩沖液的試管3，裝有Taq酶的試管4,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管5,裝有SKAl基因檢測引物的試管6,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管7，陰性對照管8，陽性對照管9和裝有去離子水的試管10。[0047]其中PCR緩沖液的成分包括SYBR Green熒光染料，MgCl2和dNTPs。[0048]其中SKAl基因檢測引物包括[0049]SKAl基因5’檢測引物，其序列為[0050]5’ -TGATGTGCCAGGAAGGTGAC-3’ ；[0051]SKAl基因3，檢測引物，其序列為[0052]5， -CAAAGGATACAGATGAACA`ACAGC-3，。[0053]其中內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因檢測引物[0054]GAPDH 基因 5’ 引物，其序列為5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ；[0055]GAPDH 基因 3’ 引物，其序列為5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。[0056]其中內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品是GAPDH基因。其中陰性對照為無SKAl表達(dá)的cDNA樣本，陽性對照為有SKAl表達(dá)的cDNA樣本。本試劑盒保存于_4°C，盡量減少反復(fù)凍融。[0057]實施例2 SKAl基因檢測試劑盒對肺癌組織中SKAl基因表達(dá)的檢測[0058]I組織總RNA提取[0059](I)取200mg臨床病理標(biāo)本肺癌組織，放到1. 5ml EP管中，加入ImlTrizol剪碎。[0060](2)震蕩 30s。[0061](3)力口 O. 2ml氯仿,劇烈搖動15s,室溫5min。[0062](4) 12000rpm, 4°C 離心，15min。[0063](5)吸上層無色水相，移入另一 EP管中(約O. 5ml)。[0064](6)加等體積異丙醇，-20°C,30min。[0065](7) 12000rpm,4°C離心，IOmin,得到 RNA 沉淀。[0066](8)棄上清，加75%乙醇1ml，混勻。[0067](9) 12000rpm,4°C離心，lOmin。[0068](10)重復(fù)步驟(8)- (9)。[0069](11)棄上清，室溫干燥IOmin。[0070](12)將沉淀溶于8 μ I DEPC水，取2 μ I測0D260/0D280，總RNA產(chǎn)物的濃度為3. 95 μ j /μ 1°[0071]2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA (采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，商品號D6110A)[0072]在 PCR 管(EP 管)中配制 15μ I 混合液01igodT (IOppM) 7. 5 μ I, dNTPMixture(10mM)l μ 1，前述步驟所得總RNA產(chǎn)物O. 5 μ g，其余部分為DEPC處理過的水。將上述反應(yīng)體系在72°C處理10分鐘，置于冰上。[0073]在上述PCR管(EP管)中配制以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述變性、退火后反應(yīng)液15 μ 1，5XPrime Script 緩沖液 4 μ I, RNA 酶抑制劑(40U/μ I) O. 5 μ I, Prime Script 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ I) O. 5 μ I,反應(yīng)液總體積為20 μ I0[0074]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為[0075](I) 42。。，50 分鐘，[0076](2)50°C，10 分鐘，[0077](3)95°C，10 分鐘，[0078](4)置于冰上。[0079]所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以保存于-20°C冰箱，或直接進(jìn)行檢測。[0080]3熒光定量PCR檢測SKAl基因表達(dá)(采用實施例1試劑盒)[0081]配制熒光定量PCR反應(yīng)液1 μ I檢測樣品，樣品分別為步驟2所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA、陰性對照(不含SKAl基因的cDNA樣本)和陽性對照(含有SKAl基因表達(dá)的cDNA樣本)，引物分別為SKAl基因檢測弓丨物和GAPDH引物。內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品弓丨物不與SKAl引物同時使用，而是同一次qPCR中分別使用內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物及SKAl引物。正反向引物混合物0.8 μ 1， 5μ I PCR緩沖液，0.5μ1 Taq DNA聚合酶4和17 . 7 μ I去離子水10，反應(yīng)液總體積為25 μ I。[0082]將裝有不同樣品的PCR管放入熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序為[0083](I) 95O I 分鐘，[0084](2)95°C5 秒，[0085](3)60°C 20秒，讀板，其中步驟(2) (3)重復(fù)40個循環(huán)；[0086](4) 65°C 95°C，每循環(huán)提高O. 5°C，維持5秒后讀板，繪制溶解曲線。[0087]結(jié)果分析根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果繪制陰性對照，陽性對照以及檢測樣本中SKAl 基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，同時繪制內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品GAPDH基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，其結(jié)果分別如圖2 (A、B)，圖3 (A、B)，圖4 (A、B)，圖5 (A、B、C)和圖6 (A、B、C)所示。[0088]將熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物，確定無非特異性擴(kuò)增。從陽性對照樣品擴(kuò)增曲線可知，SKAl基因檢測試劑盒能特異性檢測SKAl基因陽性標(biāo)準(zhǔn)分子，其檢測結(jié)果為陽性，而陰性對照樣品沒有規(guī)則擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果為陰性。[0089]對熒光定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)使用2_Λ Δε 法進(jìn)行分析，陽性對照中SKAl表達(dá)平均數(shù)值為1，誤差為(±0. 0426)，肺癌組織中SKAl表達(dá)平均數(shù)值也同樣為1，誤差為(±0. 0767)， 陰性對照由于未擴(kuò)增出條帶，所以表達(dá)數(shù)值為(_)。其數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表I和表2所示。[0090]表I熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果[0091]
權(quán)利要求1.一種SKAl基因檢測試劑盒，其特征在于，其包括盒體(I )，襯墊(2)，裝有PCR緩沖液的試管(3)，裝有Taq酶的試管(4)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5)，裝有SKAl基因檢測引物的試管(6)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7)，陰性對照管(8)，陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)，所述的襯墊(2)設(shè)置于盒體(I)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，所述的裝有PCR 緩沖液的試管(3)，裝有Taq酶的試管(4)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5)，裝有SKAl基因檢測引物的試管(6)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7)，陰性對照管(8)，陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)放置于容器孔內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的SKAl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)上的容器孔有8個，每個容器孔內(nèi)分別放置裝有PCR緩沖液的試管(3)，裝有Taq酶的試管(4)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5)，裝有SKAl基因檢測引物的試管(6)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7)， 陰性對照管(8)，陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)。
3.如權(quán)利要求2所述的SKAl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的容器孔在襯墊(2) 上分成兩排平行排列。
專利摘要本實用新型公開了一種SKA1基因檢測試劑盒。其包括盒體(1)，襯墊(2)，所述的襯墊(2)設(shè)置于盒體(1)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有容器孔裝有PCR緩沖液的試管(3)，裝有Taq酶的試管(4)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5)，裝有SKA1基因檢測引物的試管(6)，裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7)，陰性對照管(8)，陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)分別放置于容器孔內(nèi)。該檢測試劑盒可用于檢測SKA1基因的表達(dá)情況，所述檢測的方法簡便，檢測效率高。
文檔編號C12M1/34GK202881272SQ20122056872
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者姚陽, 沈贊, 勞昕元, 余文熙 申請人:上海黃離生物科技有限公司