專利名稱:一種ska1基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
—種SKA1基因檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種SKAl基因檢測試劑盒。
背景技術(shù):
SKAl (The spindle and kinetochore associated complex subunit I)基因定位于染色體18q21.1,編碼含有255個氨基酸、分子量約為30kDa的蛋白。目前對SKAl 蛋白結(jié)構(gòu)的研究還不深入,只明確了其在N端具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Rual JF, Venkatesan K,Hao T,et al.Towards a proteome—scale map of thehuman protein-protein interaction network. Nature 2005;437:1173-1178·)。最初質(zhì)譜分析結(jié)果表明,SKAl 蛋白被確定為紡錘體的組成部分(Cheeseman IMj Brew Cj Wolyniak Mj et al.1mplication of a novel multiprotein Damlp complexin outer kinetochore function. J Cell Biol. 2001;155:1137-1145.)。后來通過酵母雙雜試驗,發(fā)現(xiàn)了紡錘體著絲點復(fù)合物(The spindle and kinetochoreassociated complex, SKA)的另一個亞基 SKA2,體外和體內(nèi)研究結(jié)果均表明,SKAl和SKA2相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體,對于SKA2的穩(wěn)定以及SKA蛋白在著絲點和微管中的定位是必須的(Hanisch A.,Sillje HHW, Nigg EA. Timely anaphase onset requires a novel spindle and kinetochore complexcomprising Skaland Ska2. EMBO J. 2006;25:5504-5515. )。SKA復(fù)合體對于有絲分裂至關(guān)重要,可以使所有染色體的著絲點都排列在赤道板平面上,這對于確保染色體均等分配和維持基因組穩(wěn)定性十分必要。 有絲分裂后期,染色體在紡錘體著絲點微管的作用下移向兩極,并導(dǎo)致紡錘體檢查點沉默, 在這個過程中SKAl復(fù)合體也是必須的蛋白。然而在當(dāng)時的研究中,SKAl在染色體分離中的作用并沒有闡述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J雜志上的報道闡述了 SKAl復(fù)合體在著絲點和微管界面上發(fā)揮功能,并與微管直接作用,在微管上形成低聚裝配體,沿著微管以一種解聚-偶聯(lián)的方式運動,參與有絲分裂期間染色體的運動(Welburn JPIj Grishchuk ELj Backer CBj et al. The human kinetochore Ska lcomplex facilitates microtubuled epolymerization-coupled motility. Dev Cell 2009;16:374-385·)。[0003]基因組研究表明,SKAl基因所處的18q21.1與慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生有關(guān)(Crowther-Swanepoel D,Broderick P,Di Bernardo MCj et al. Common variants at 2q37. 3,8q24. 21,15q21. 3and 16q24.1influence chroniclymphocytic leukemia risk. Nature genetics 2010;42:132-136.)。這意味著SKAl可能通過調(diào)節(jié)有絲分裂過程、細(xì)胞周期進(jìn)展的方式參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。另外,在最初解析SKAl功能的研究中,以微管解聚藥物噻氨酯ii_(nocodazole)和秋水仙堿(colchicine)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)SKAl在著絲點中的積聚水平降低;對阻滯于有絲分裂期間的細(xì)胞,加nocodazole處理,可導(dǎo)致SKAl和微管先后從著絲點上脫離;相反地,當(dāng)細(xì)胞免除了 nocodazole的處理時,SKAl蛋白在著絲點上的定位得以恢復(fù),相應(yīng)的,紡錘體重新形成。而微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol),并沒有影響 SKAl 在著絲點上的定位(SauerG,Korner R,Hanisch A, et al. Proteome analysis of the human mitotic spindle. Mol Cell Proteomics 2005; 4:35-43.)。這些研究都提不了 SKAl可能影響某些抗腫瘤藥物敏感性。因此,了解SKAl基因在腫瘤中的表達(dá)情況,具有很強(qiáng)的臨床實用價值。實用新型內(nèi)容[0004]本實用新型所要解決的技術(shù)問題就是針對目前對SKAl基因表達(dá)檢測特異性不強(qiáng),檢測成本較高而且方法較復(fù)雜的不足之處,提供了一種特異性高,使用簡便的SKAl基因檢測試劑盒。[0005]本實用新型解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案之一為一種SKAl基因檢測試劑盒,其包括盒體,襯墊,PCR緩沖液,Taq酶,內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品,SKAl基因檢測引物,內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物,陰性對照,陽性對照和裝有去離子水的試管。所述的襯墊設(shè)置于盒體內(nèi),襯墊上設(shè)有容器孔,所述的裝有PCR緩沖液的試管,裝有Taq酶的試管,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管,裝有 SKAl基因檢測引物的試管,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管,陰性對照管,陽性對照管和裝有去離子水的試管放置于容器孔內(nèi)。[0006]其中所述襯墊上的容器孔較佳的為8個,所述的容器孔在襯墊上較佳地為分成兩排平行排列。其中所述PCR緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR緩沖液。所述PCR緩沖液較佳地包括dNTPs,MgCl2和熒光染料SYBR Green。其中所述dNTPs為常規(guī)dNTPs。所述MgCl2為本領(lǐng)域常規(guī)MgCl2,其濃度較佳地為4 6mM。[0007]其中所述SKAl基因檢測引物優(yōu)選地為[0008]SKAl 基因 5’ 檢 測引物,其序列為5’ -TGATGTGCCAGGAAGGTGAC-3’ ;[0009]SKAl基因3’檢測引物,其序列為[0010]5,-CAAAGGATACAGATGAACAACAGC-3,。[0011]其中所述內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物為[0012]GAPDH 基因 5’ 引物,其序列為5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ;[0013]GAPDH 基因 3’ 引物,其序列為5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。[0014]其中所述Taq酶為本領(lǐng)域常規(guī)Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶較佳地包括目前商品化的各種Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶的生產(chǎn)廠商較佳地包括TAKARA, New England biolabs, Invitrogen 或Promega。[0015]其中所述內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)選GAPDH基因。[0016]其中所述陰性對照為本領(lǐng)域常規(guī)的陰性對照,本實用新型優(yōu)選為無SKAl基因表達(dá)的cDNA樣本。其中所述陽性對照為本領(lǐng)域常規(guī)的陽性對照,本實用新型優(yōu)選為有SKAl 基因表達(dá)的cDNA樣本。其中所述去離子水為本領(lǐng)域常規(guī)去離子水。[0017]本實用新型所述SKAl基因 檢測試劑盒可以高效檢測SKAl基因的表達(dá)情況。所述檢測較佳地在熒光定量PCR儀上進(jìn)行,所述熒光定量PCR儀較佳地包括各種商品化的熒光定量PCR儀。所述突光定量PCR儀廠商較佳地為Applied Biosystems公司或Bio-rad公司。[0018]本實用新型所述SKAl基因檢測試劑盒的保藏條件較佳地為_4°C,盡量減少反復(fù)凍融。[0019]本實用新型所述SKAl基因檢測試劑盒的較佳應(yīng)用實例為[0020]首先通過提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。[0021]其次,用無菌去離子水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為IX IO8 IX IO12拷貝/ml。[0022]第三步,配制熒光定量PCR反應(yīng)液1μ I檢測樣品,樣品分別為第一步所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,標(biāo)準(zhǔn)品(GAPDH基因),陰性對照(不含SKAl基因的cDNA樣本)和陽性對照(含有SKAl基因的cDNA樣本),5μ I PCR5X緩沖液,I μ I SKAl基因檢測引物,I μ I內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物,O. 5μ I Taq DNA聚合酶和16. 5 μ I去離子水。反應(yīng)液總體積為25 μ 1,在熒光定量 PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。[0023]qPCR反應(yīng)程序優(yōu)選地為[0024](I) 95O I 分鐘,[0025](2)95°C5 秒,[0026](3)60°C 20秒,讀板,其中步驟(2) (3)重復(fù)40個循環(huán);[0027](4) 65°C 95°C,每循環(huán)提高O. 5°C,維持5秒后讀板,繪制熔解曲線。[0028]根據(jù)熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物,確定無非特異性擴(kuò)增,根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別計算樣本中SKAl基因和GAPDH的表達(dá)量(拷貝/μ 1),SKAl基因與GAPDH表達(dá)量的比值即為 SKAl基因的表達(dá)指數(shù)。[0029]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上,上述各優(yōu)選條件,可任意組合,即得本實用新型較佳實例。[0030]本實用新型所用試劑和原料均市售可得。[0031]本實用新型的積極進(jìn)步效果在于本實用新型提供的SKAl基因檢測試劑盒,通過優(yōu)化設(shè)計SKAl基因的引物和PCR條件,克服了普通熒光定量PCR檢測步驟復(fù)雜,假陽性率高的缺陷,不僅保證了熒光定量PCR反應(yīng)的高靈敏性,而且使被檢測基因的特異性大大提高。本實用新型提供的SKAl基因檢測試劑盒設(shè)計合理,無需設(shè)計針對SKAl基因的熒光探針,檢測操作方便而且節(jié)約成本。
[0032]圖1為SKAl基因檢測試劑盒結(jié)構(gòu)不意圖。[0033]圖2 (A)為陰性對照的SKAl基因擴(kuò)增曲線,其中a為陰性對照重復(fù)l,b為陰性對照重復(fù)2,c為陰性對照重復(fù)3。圖2 (B)為陰性對照的SKAl基因熔解曲線,其中a為陰性對照重復(fù)1,b為陰性對照重復(fù)2,c為陰性對照重復(fù)3。[0034]圖3 (A)為陽性對照的SKAl基因擴(kuò)增曲線,其中d為陽性對照重復(fù)l,e為陽性對照重復(fù)2,f為陽性對照重復(fù)3。圖3 (B)為陽性對照SKAl基因熔解曲線,其中d為陽性對照重復(fù)1,e為陽性對照重復(fù)2,f為陽性對照重復(fù)3。[0035]圖4 (A)為檢測樣本 的SKAl基因擴(kuò)增曲線,其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)I, i為檢測樣本重復(fù)2,h為檢測樣本重復(fù)3。圖4 (B)為檢測樣本SKAl基因熔解曲線,其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)1,i為檢測樣本重復(fù)2,h為檢測樣本重復(fù)3。[0036]圖5 (A)為陰性對照GAPDH基因擴(kuò)增曲線,其中a為陰性對照重復(fù)1,b為陰性對照重復(fù)2,c為陰性對照重復(fù)3。圖5 (B)為陽性對照GAPDH基因擴(kuò)增曲線,其中d為陽性對照重復(fù)l,e為陽性對照重復(fù)2,f為陽性對照重復(fù)3。圖5 (C)為檢測樣本GAPDH基因擴(kuò)增曲線,其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)1,h為檢測樣本重復(fù)2,i為檢測樣本重復(fù)3。[0037]圖6 (A)為陰性對照GAPDH基因熔解曲線,其中a為陰性對照重復(fù)1,b為陰性對照重復(fù)2,c為陰性對照重復(fù)3。圖6 (B)為陽性對照GAPDH基因熔解曲線,其中d為陽性對照重復(fù)l,e為陽性對照重復(fù)2,f為陽性對照重復(fù)3。圖6 (C)為檢測樣本GAPDH基因熔解曲線,其中g(shù)為檢測樣本重復(fù)l,h為檢測樣本重復(fù)2,i為檢測樣本重復(fù)3。
具體實施方式
[0038]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本實用新型,但并不因此將本實用新型限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規(guī)方法和條件, 或按照商品說明書選擇。所述的室溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫溫度,較佳地為20 40°C。[0039]逆轉(zhuǎn)錄試劑盒=TAKARA大連,商品編號D6110A,[0040]7500型定量PCR儀美國ABI公司,[0041]Trizol 試劑,DEPC 水美國 Invitrogen 公司,[0042]異丙醇,乙醇,氯仿試劑上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,[0043]SYBR Green 突光染料美國 Ivitrogen 公司。[0044]實施例1 SKAl基因檢測試劑盒[0045]結(jié)合圖1,本實用新型SKAl基因檢測試劑盒包括盒體1,襯墊2,裝有PCR緩沖液的試管3,裝有Taq酶的試管4,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管5,裝有SKAl基因檢測引物的試管 6,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管7,陰性對照管8,陽性對照管9和裝有去離子水的試管10。[0046]其中襯墊2設(shè)置于盒體I內(nèi),襯墊2上設(shè)有8個容器孔,所述的容器孔在襯墊2上分成兩排平行排列。每個容器孔內(nèi)分別放置上述裝有PCR緩沖液的試管3,裝有Taq酶的試管4,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管5,裝有SKAl基因檢測引物的試管6,裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管7,陰性對照管8,陽性對照管9和裝有去離子水的試管10。[0047]其中PCR緩沖液的成分包括SYBR Green熒光染料,MgCl2和dNTPs。[0048]其中SKAl基因檢測引物包括[0049]SKAl基因5’檢測引物,其序列為[0050]5’ -TGATGTGCCAGGAAGGTGAC-3’ ;[0051]SKAl基因3,檢測引物,其序列為[0052]5, -CAAAGGATACAGATGAACA`ACAGC-3,。[0053]其中內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因檢測引物[0054]GAPDH 基因 5’ 引物,其序列為5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ ;[0055]GAPDH 基因 3’ 引物,其序列為5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。[0056]其中內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品是GAPDH基因。其中陰性對照為無SKAl表達(dá)的cDNA樣本,陽性對照為有SKAl表達(dá)的cDNA樣本。本試劑盒保存于_4°C,盡量減少反復(fù)凍融。[0057]實施例2 SKAl基因檢測試劑盒對肺癌組織中SKAl基因表達(dá)的檢測[0058]I組織總RNA提取[0059](I)取200mg臨床病理標(biāo)本肺癌組織,放到1. 5ml EP管中,加入ImlTrizol剪碎。[0060](2)震蕩 30s。[0061](3)力口 O. 2ml氯仿,劇烈搖動15s,室溫5min。[0062](4) 12000rpm, 4°C 離心,15min。[0063](5)吸上層無色水相,移入另一 EP管中(約O. 5ml)。[0064](6)加等體積異丙醇,-20°C,30min。[0065](7) 12000rpm,4°C離心,IOmin,得到 RNA 沉淀。[0066](8)棄上清,加75%乙醇1ml,混勻。[0067](9) 12000rpm,4°C離心,lOmin。[0068](10)重復(fù)步驟(8)- (9)。[0069](11)棄上清,室溫干燥IOmin。[0070](12)將沉淀溶于8 μ I DEPC水,取2 μ I測0D260/0D280,總RNA產(chǎn)物的濃度為3. 95 μ j /μ 1°[0071]2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA (采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,商品號D6110A)[0072]在 PCR 管(EP 管)中配制 15μ I 混合液01igodT (IOppM) 7. 5 μ I, dNTPMixture(10mM)l μ 1,前述步驟所得總RNA產(chǎn)物O. 5 μ g,其余部分為DEPC處理過的水。將上述反應(yīng)體系在72°C處理10分鐘,置于冰上。[0073]在上述PCR管(EP管)中配制以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述變性、退火后反應(yīng)液15 μ 1,5XPrime Script 緩沖液 4 μ I, RNA 酶抑制劑(40U/μ I) O. 5 μ I, Prime Script 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ I) O. 5 μ I,反應(yīng)液總體積為20 μ I0[0074]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為[0075](I) 42。。,50 分鐘,[0076](2)50°C,10 分鐘,[0077](3)95°C,10 分鐘,[0078](4)置于冰上。[0079]所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以保存于-20°C冰箱,或直接進(jìn)行檢測。[0080]3熒光定量PCR檢測SKAl基因表達(dá)(采用實施例1試劑盒)[0081]配制熒光定量PCR反應(yīng)液1 μ I檢測樣品,樣品分別為步驟2所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA、陰性對照(不含SKAl基因的cDNA樣本)和陽性對照(含有SKAl基因表達(dá)的cDNA樣本),引物分別為SKAl基因檢測弓丨物和GAPDH引物。內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品弓丨物不與SKAl引物同時使用,而是同一次qPCR中分別使用內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物及SKAl引物。正反向引物混合物0.8 μ 1, 5μ I PCR緩沖液,0.5μ1 Taq DNA聚合酶4和17 . 7 μ I去離子水10,反應(yīng)液總體積為25 μ I。[0082]將裝有不同樣品的PCR管放入熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序為[0083](I) 95O I 分鐘,[0084](2)95°C5 秒,[0085](3)60°C 20秒,讀板,其中步驟(2) (3)重復(fù)40個循環(huán);[0086](4) 65°C 95°C,每循環(huán)提高O. 5°C,維持5秒后讀板,繪制溶解曲線。[0087]結(jié)果分析根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果繪制陰性對照,陽性對照以及檢測樣本中SKAl 基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線,同時繪制內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品GAPDH基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線,其結(jié)果分別如圖2 (A、B),圖3 (A、B),圖4 (A、B),圖5 (A、B、C)和圖6 (A、B、C)所示。[0088]將熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,根據(jù)熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物,確定無非特異性擴(kuò)增。從陽性對照樣品擴(kuò)增曲線可知,SKAl基因檢測試劑盒能特異性檢測SKAl基因陽性標(biāo)準(zhǔn)分子,其檢測結(jié)果為陽性,而陰性對照樣品沒有規(guī)則擴(kuò)增曲線,檢測結(jié)果為陰性。[0089]對熒光定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)使用2_Λ Δε 法進(jìn)行分析,陽性對照中SKAl表達(dá)平均數(shù)值為1,誤差為(±0. 0426),肺癌組織中SKAl表達(dá)平均數(shù)值也同樣為1,誤差為(±0. 0767), 陰性對照由于未擴(kuò)增出條帶,所以表達(dá)數(shù)值為(_)。其數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表I和表2所示。[0090]表I熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果[0091]
權(quán)利要求1.一種SKAl基因檢測試劑盒,其特征在于,其包括盒體(I ),襯墊(2),裝有PCR緩沖液的試管(3),裝有Taq酶的試管(4),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5),裝有SKAl基因檢測引物的試管(6),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7),陰性對照管(8),陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10),所述的襯墊(2)設(shè)置于盒體(I)內(nèi),襯墊(2)上設(shè)有容器孔,所述的裝有PCR 緩沖液的試管(3),裝有Taq酶的試管(4),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5),裝有SKAl基因檢測引物的試管(6),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7),陰性對照管(8),陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)放置于容器孔內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的SKAl基因檢測試劑盒,其特征在于,所述襯墊(2)上的容器孔有8個,每個容器孔內(nèi)分別放置裝有PCR緩沖液的試管(3),裝有Taq酶的試管(4),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5),裝有SKAl基因檢測引物的試管(6),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7), 陰性對照管(8),陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)。
3.如權(quán)利要求2所述的SKAl基因檢測試劑盒,其特征在于,所述的容器孔在襯墊(2) 上分成兩排平行排列。
專利摘要本實用新型公開了一種SKA1基因檢測試劑盒。其包括盒體(1),襯墊(2),所述的襯墊(2)設(shè)置于盒體(1)內(nèi),襯墊(2)上設(shè)有容器孔裝有PCR緩沖液的試管(3),裝有Taq酶的試管(4),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品的試管(5),裝有SKA1基因檢測引物的試管(6),裝有內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品引物的試管(7),陰性對照管(8),陽性對照管(9)和裝有去離子水的試管(10)分別放置于容器孔內(nèi)。該檢測試劑盒可用于檢測SKA1基因的表達(dá)情況,所述檢測的方法簡便,檢測效率高。
文檔編號C12M1/34GK202881272SQ20122056872
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者姚陽, 沈贊, 勞昕元, 余文熙 申請人:上海黃離生物科技有限公司